抗氧化剂作为食品添加剂可以帮助防止食品变质，但摄入过量会对人体有害，因此对抗氧化剂的检测非常重要。最近小编收到反馈，按照国标GB 5009.32-2016 《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》第一法高效液相色谱法的前处理操作，9种抗氧化剂的回收率都较差，因此，小编进行了一系列的优化，下面小编就和大家分享一下优化的过程，顺便给大家讲述一下，使用SPE进行前处理，回收率不好时的一些优化步骤。
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固相萃取小柱的选择和分布收集
在国标GB 5009.32-2016中，采用的是C18固相萃取柱，而小编想选择另一种小柱和C18进行比较，查阅资料后发现PSD小柱和C18相似，但又具有一些优点，PSD具有疏水的表面，属于非极性的固相萃取材料，由于PSD的苯环的电子云能够与目标化合物的π键作用，使得PSD的吸附能力比C18反相吸附剂更强。与反相硅胶吸附剂比较，聚合物填料在耐酸碱方面性能要好很多，通常在pH1~14的范围都是稳定的。另外由于PSD没有键合硅胶存在的硅羟基，所以无需考虑硅羟基对萃取可能造成的影响。因此选择了PSD和C18一起实验进行比较。
在SPE操作过程中，分布收集是一种非常实用的实验技巧，分布收集就是通过收集上样液、淋洗液、洗脱液甚至进行二次洗脱，并上机分析，从而判断目标化合物具体损失的环节，明确实验步骤中具体需要优化的环节。
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根据以上讲述，确定实验方案。小编进行了一次实验，得出了实验数据。
基质
植物油
准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加标（1000ppm，100ul），加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待上样。（实验过程记得避光操作）
净化
小柱：
SBEQ-CA0858 CNWBOND HC-C18 SPE 小柱2g/10ml，
SBEQ-CA3554 CNW Poly-Sery PSD SPE 小柱 500mg/6ml。
活化：5ml甲醇
平衡：5ml乙腈
上样：全部待净化液 ，收集
洗脱：5ml乙腈：甲醇（2:1），收集
二次洗脱：10ml乙腈：甲醇（2:1），收集
40度氮吹至干，加2ml乙腈定容，,过0.22μm PTFE滤膜，上机分析。
平行样：两款小柱，每个做一个基质空白，两个基质加标。
通过以上实验数据，我们可以看到上样液中检测到大部分的目标物，两种小柱对9种抗氧化剂的保留率都非常低，二次洗脱中有少量的目标物，而且比较上样、洗脱和二次洗脱回收率之和可以发现，HC-18和PSD小柱对TBHQ和BHT的回收率均较低，且PSD小柱对9种抗氧化剂的回收率高于HC-C18小柱对9种抗氧化剂的回收率。
因此，接下来的实验就需要增加洗脱液体积，上样液和洗脱液一起接收，并且想办法提高TBHQ和BHT的回收率，另外，只选择了PSD小柱进行实验。
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添加保护剂
为什么TBHQ和BHT的回收率依然低，小编苦思冥想，并查阅资料和文献，终于在一份行业标准中发现了秘密，在行业标准SNT3849-2014《出口食品中多种抗氧化剂的测定》中，在进行抗氧化剂的提取时，它在提取溶剂正己烷饱和的乙腈中添加了L-抗坏血酸棕榈酸酯（AP），L-抗坏血酸棕榈酸酯( AP) 对金属离子有螯合作用能够促进氧化的微量金属离子钝化，从而降低抗氧化剂在提取和浓缩过程中被氧化的程度， 减缓抗氧化剂的氧化速率，提高回收率。另外，在试验确定的检测条件下 AP 不会对其他抗氧化剂造成干扰。
小编采用PSD小柱又进行了一次实验，添加AP和不添加AP 进行比较，实验方案和实验数据如下。
基质
植物油
含AP的正己烷饱和的乙腈溶液：1L正己烷饱和的乙腈中溶解0.1gL-抗坏血酸棕榈酸酯（AP)
前处理1：准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加标（1000ppm,100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待上样。（实验过程记得避光操作）
前处理2：准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加标（1000ppm,100ul),加入5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用5mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用5mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液溶液提取2次，合并3次提取液，待上样。（实验过程记得避光操作）
净化
小柱：SBEQ-CA3554 CNW Poly-Sery PSD SPE小柱 500mg/6ml
活化：5ml甲醇
平衡：5ml乙腈
上样：全部待净化液 ，收集
洗脱：15ml乙腈：甲醇（2:1），收集
40度氮吹至干，加2ml乙腈定容，过0.22μm PTFE滤膜，上机分析。
平行样：每种前处理方法做一个基质空白，两个基质加标
可以发现，添加AP后，TBHQ回收率已达到90%以上，而BHT虽然有提高，但是回收率依然达不到要求，因此还需要进行再次优化。
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增加提取次数
BHT的回收率依然不好，小编也很苦恼，又进行了一系列实验，比如氮吹不吹干等，发现回收率依然没有提高，在这种情况下，小编测了一下提取液的回收率，果然，BHT的回收率只有60%，这可能是由于BHT易溶于油脂中，在液液萃取过程中不容易提取出来。因此，小编遵循“少量多次”的提取原则，将国标GB 5009.32-2016中的提取次数由3次增加到了5次，发现BHT的回收率终于达到了80%以上，不枉小编辛苦了那么长时间。最终确定的实验方案和实验数据如下。
基质
植物油
含AP的正己烷饱和的乙腈溶液：1L正己烷饱和的乙腈中溶解0.1gL-抗坏血酸棕榈酸酯（AP)
准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50mL离心管中，加入3mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1min，静置10min，用3mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2min，3000r/min离心5min，收集乙腈层于另一50mL离心管中，再重复使用3mL含AP的正己烷饱和的乙腈溶液提取4次，合并5次提取液，待上样。
净化
小柱：SBEQ-CA3554 CNW Poly-Sery PSD SPE小柱 500mg/6m
活化：5ml甲醇
平衡：5ml乙腈
上样：全部待净化液 ，收集
洗脱：15ml乙腈：甲醇（2:1），收集
全部上样液和洗脱液一起收集浓缩，在40℃下旋蒸至1ml左右，转移至15mL离心管中，用少量乙腈润洗旋蒸瓶3次，合并后40℃氮吹至0.5mL，用乙腈定至2mL，涡旋30s，过0.22um PVDF或PTFE滤头后，用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器测定。
平行样：一个基质空白，两个基质加标
最后，让我们总结一下，进行SPE操作回收率不好时，该怎么优化。最重要一步的就是分布收集，发现目标物损失的步骤，进行改善，如果回收率依然不好，就需要考虑提取的步骤，目标物的性质（是不是易降解）等，您学会了吗？
