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斑马鱼行为篇：基于斑马鱼模型的药物安全性评价指标

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2024-09-23 20:03

斑马鱼作为一类脊椎模式动物，具备体型小、繁殖率高、传代周期短、体外受精发育、胚胎透明、饲养管理方便等优势，在毒理学研究领域发挥着越来越重要的作用。同时斑马鱼的胎心类似于人类胚胎的心脏，分为心房和心室，房室之间有瓣膜，因而为研究人类心血管系统提供了一类较好的模型。而且，斑马鱼幼鱼早期发育存活不完全依赖于血液循环，可用显微镜直接观察活鱼卵心脏的明显形态和功能缺陷，或通过分子标记物来识别细微差别。胚胎透明易观察等优点，在高通量筛选、毒理学研究方面有其独特优势。斑马鱼在发育初期完全透明，荧光转基因斑马鱼cmlc2：GFP及gz15Tg/+（AB）使得心脏及肝脏形态观察更加方便，并广泛用于毒理学研究。以荧光转基因斑马鱼为模型，可进行发育毒性、心脏毒性、肝脏毒性、肾脏毒性进行观察评价。

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雌雄斑马鱼培养于28℃水循环系统中，交配产卵时，于前1日下午将雌雄斑马鱼按1∶1置于交配缸中并用隔板隔开。次日早上抽取隔板进行交配，抽取隔板1h后收集受精卵，除去杂物、死卵、未受精卵后，将健康的受精卵置于28℃培养箱中培养。

例：交泰丸水提物（黄连-肉桂10∶1）制备

取肉桂粗粉10g，加8倍水浸泡1h，蒸馏5h，收集挥发油，蒸馏后的水溶液滤过另器收集；取黄连粗粉100g，用10倍量的水浸泡1h，肉桂药渣和黄连煎煮3次，第1次2h，第2次1.5h，第3次1h。滤过，合并滤液与上述蒸馏水溶液，常压浓缩至1mL相当于原药材1.2g，将浓缩液在60℃水浴蒸发水分得稠膏。干燥（60℃）36h，干膏研成粉末状，将肉桂挥发油与干膏粉混匀为实验药品，置4℃冰箱保存。临用时精密称取实验药品约10mg，用5%DMSO水溶液溶解成50mg·L-1的储备液，超声30min溶解，配制完成后4℃冰箱保存备用，实验前涡旋仪混匀，用5%DMSO水溶液稀释至实验所需浓度。稀释后将药物混悬液按1∶9的比例加入胚胎水中。

斑马鱼胚胎半数致死量（LD50）的测定

显微镜下选取正常发育受精后4dpf的斑马鱼胚胎，并将其随机转移到含有培养液和不同浓度样品溶液的24孔板中，每孔10枚胚胎，设3个复孔。置于28℃恒温培养箱中培养，每隔24h更换1次含药培养液，培育至7dpf。根据预实验，设置7个给药浓度，另设空白组，每个浓度3个复孔，给药后每24h观察斑马鱼胚胎孵化及死亡情况并记录，重复3次实验。实验完成后，整理数据并进行分析，绘制量-毒曲线图，计算LD50。

斑马鱼胚胎形态学测定

处理后72h的斑马鱼胚胎，移去含药培养液，用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中，于体视显微镜下拍照，并用Dianoscope软件进行分析，对斑马鱼胚胎的体长，眼睛大小进行测量。

斑马鱼胚胎心脏毒性评价

将不同给药组处理后72h的斑马鱼胚胎，移去含药培养液，用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中，于体视显微镜下观察并录制视频，并用Dianoscope软件进行分析。

将不同给药组处理后72h的斑马鱼胚胎，移去含药培养液，用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中，并加入适量鱼安定，使心脏停止跳动，于体视显微镜下观察并拍照。拍照后固定，用共聚焦扫描显微镜对斑马鱼心脏进行拍照，并利用ImageJ软件对静脉窦-动脉球（SV-BA）间距，心包、心房、心室面积，瓣膜间距（AVchannel）及入血口（Inflow）距离进行统计分析。

斑马鱼幼鱼肝肾毒性测定

选取低于LD0的3个浓度，另增加何首乌提取物100mg·L-1及马兜铃酸8mg·L-1组作为阳性药组。处理后72h的斑马鱼幼鱼，移去含药培养液，用胚胎培养水清洗3次后转移至盛有3%甲基纤维素钠水溶液的培养盘中，于荧光显微镜下拍照。

斑马鱼幼鱼肝、肾生化指标测定

显微镜下选取正常发育受精后4dpf的斑马鱼胚胎，并将其随机转移到含有培养液和不同浓度样品溶液的12孔板中，每孔30枚胚胎，设3个复孔，给药浓度同2.5.1项。置于28℃恒温培养箱中培养，每隔24h更换1次含药培养液，培育至7dpf，移去含药培养液，用胚胎培养水清洗3次后转移至1.5mL离心管中，吸干水分后迅速转移至干冰中，待斑马鱼幼鱼完全冷冻后再转移至-80℃冰箱中保存，随后按照试剂盒的相关步骤进行ALT，AST酶活性测定及肌酐含量测定。

交泰丸水提物对斑马鱼胚胎的量-毒曲线

对斑马鱼胚胎生长发育的影响空白组斑马鱼胚胎发育正常，状态良好，无死亡现象。与空白组比较，交泰丸各给药组，125mg·L-1未见明显形态学改变，250，500mg·L-1给药组可以观察到头部变小，体长变短，眼睛半径减小，表明交泰丸水提物可延缓发育，且呈一定的剂量依赖性。

参考文献：

1、Cardiogenesis impairment promoted by bisphenol A exposure is successfully counteracted by epigallocatechin gallate[J]. Marta Lombó;;Silvia González-Rojo;;Cristina Fernández-Díez;;María Paz Herráez.Environmental Pollution,2019

2、Cardiotoxicity evaluation of nine alkaloids from Rhizoma Coptis[J]. MY Zhang;;YY Yu;;SF Wang;;Q Zhang;;HW Wu;;JY Wei;;W Yang;;SY Li;;HJ Yang.Human and Experimental Toxicology,2018(2)

3、张明哲,陈章美,莫柳英,等.基于斑马鱼模型的交泰丸安全性评价[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(18):51-57.

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