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斑马鱼行为篇㊿：斑马鱼二型糖尿病模型

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2024-09-23 20:19

目前二型糖尿病动物模型有自发性动物模型、诱发性动物模型以及转基因动物模型等，主要选用的是小鼠、大鼠、兔、狗等哺乳动物。而斑马鱼二型糖尿病模型的构建方法主要有3种：葡萄糖浸泡法、饮食诱导法和基因敲除法。与后两者相比，葡萄糖浸泡法操作简单、实验材料易得、斑马鱼死亡率低且模型相对稳定。同时，选择2%浓度的葡萄糖溶液也是因为在此浓度下，斑马鱼死亡率较低且造模效果好，过高或过低的浓度会使死亡率提高。

动物模型是研究人类疾病的重要手段，构建二型糖尿病动物模型可以更好的模拟二型糖尿病的发生发展过程，有助于探索其发病机制、为二型糖尿病患者寻找更好的治疗方式。目前二型糖尿病动物模型的构建主要采用大鼠和小鼠等啮齿动物，其繁殖周期长、成本高，而与之相比，斑马鱼动物模型具有快速、高效和低成本的特点。同时，斑马鱼基因与人类高度相似，同源性高达87%，在胰腺结构和葡萄糖稳态等方面与成年哺乳动物胰腺高度相似，因此是一种很有吸引力的二型糖尿病研究模型。目前国内外对二型糖尿病斑马鱼模型研究较少，本研究采用葡萄糖浸泡法，历时28d，成功建立了糖尿病斑马鱼模型，并对其行为学改变、体质量增长、组织葡萄糖、三酰甘油以及总胆固醇含量变化，建立了较为稳定的二型糖尿病斑马鱼模型构建体系，为临床研究提供基础和依据。

实验动物：4月龄成年野生型蓝斑马鱼，大小均一，身长为4~5cm，初始体质量每尾约0.3g，健康状况良好。斑马鱼养殖：将斑马鱼预养殖在循环水系统中7~14d以适应实验室环境。给斑马鱼喂食脱壳丰年虾卵，每日喂食两次，分别为10：00—11：00和16：00—17：00两个时间点。使用平底鱼缸进行养殖，水温为(28.5±1.0)℃；pH为7.0~7.8；使用定时开关建立光照周期为光照14h，黑暗10h；溶氧为5~8mg/L。每日更换新鲜除氯增氧水，每次更换水缸量的1/3，若有斑马鱼死亡，则需全部更换。使用温度计、pH值、亚硝酸盐、氨氯、溶解氧测定试剂盒对水质状态进行监测，并进行记录。

诱导二型糖尿病模型过程：

将大小均一的斑马鱼分为两组：对照组和实验组，每组30尾，其平均体质量均在0.25g左右。将实验组斑马鱼每隔1d浸入2%浓度的葡萄糖溶液中，对照组斑马鱼处于清水中，两组喂食量及喂食频次、光照周期、温度、pH值等其他条件保持一致，两组鱼均每日全部更换缸内水。历时28d，建立斑马鱼二型糖尿病模型，最终实验组斑马鱼可在2%浓度的葡萄糖溶液中稳定生长。

检测方法

形态学观察：观察对照组和实验组斑马鱼的形态、游动情况以及代谢物排出情况，并记录。

体质量测量：测量并记录实验组和对照组中每条鱼的初始体质量，计算平均初始体质量。之后每组选取20尾斑马鱼，每隔1周测量并记录一次，计算平均值，绘制增长曲线进行比较。

组织裂解提取：选取实验组和对照组的斑马鱼，去除其脑及内脏，剩余组织在液氮中研磨成粉末状，后加入组织裂解液进行组织裂解，收集裂解液，离心，取上清液进行检测；组织葡萄糖含量检测：使用葡萄糖检测试剂盒，原理为葡萄糖氧化酶法；组织三酰甘油含量检测：使用三酰甘油检测试剂盒，原理为GPO-PAP法；组织总胆固醇含量检测：使用总胆固醇检测试剂盒，原理为COD-PAP法。

行为学改变

在诱导二型糖尿病模型过程中，与对照组斑马鱼相比，实验组斑马鱼在2%葡萄糖溶液中表现出明显活跃状态，其游动速度加快，对外界环境的刺激更为敏感，且排出白色絮状代谢物，而对照组斑马鱼排出棕色代谢物。在葡萄糖浸泡28d后，实验组斑马鱼眼睛呈现出红肿状态。此外，在这一过程中，对照组斑马鱼死亡3条，实验组斑马鱼死亡5条。

斑马鱼平均体质量变化

对记录的斑马鱼体质量进行统计学分析，实验组斑马鱼体质量增长明显快于对照组斑马鱼。

实验组和对照组斑马鱼平均体质量变化曲线

从形态学观察、体质量曲线绘制以及糖脂代谢生化检测3个方面来评价斑马鱼二型糖尿病模型的构建情况。在形态学方面，实验组斑马鱼在喂养过程中表现游动速度加快、对外界环境变化更为敏感、排出白色代谢物等，这是斑马鱼对高糖环境的应激反应。同时，实验组斑马鱼表现出眼睛红肿的状态，这表明斑马鱼可能出现了糖尿病并发症视网膜病变。在诱导过程中，实验组斑马鱼的体质量增长速度明显快于对照组斑马鱼，这表明高糖导致了斑马鱼的肥胖。经过28d的喂养，实验组斑马鱼身体的葡萄糖、三酰甘油和总胆固醇含量均表现为显著上升，这种状态与临床血糖血脂的检测表现呈相近趋势，表明经过2%葡萄糖溶液浸泡，斑马鱼出现糖脂代谢紊乱。2%葡萄糖溶液的环境能够引发成年斑马鱼类糖尿病症状，斑马鱼二型糖尿病模型得以成功构建。形态学观察和体质量测量能够直观的反映出实验组和对照组斑马鱼的区别，是一种简单直接的评价方式。而糖脂生化项目测量反映出代谢状态的改变。另外，本研究检测对象为去除脑和内脏的鱼组织，与传统的取血测量相比，操作更为简单，减少了由于取血不当带来的测量误差，使得指标更为稳定。

采用隔天葡萄糖浸泡法，历经28d成功构建模型，并对行为学改变、体质量增长情况、组织葡萄糖、甘油、胆固醇水平变化进行分析，建立了较为稳定、可靠的造模体系，并能够对模型进行评价。本实验模型构建方法较为简单，实验材料易得。在评价时用组织检测代替取血检测，简化了实验方法，并增加生化指标来评估模型的构建情况，进一步揭示了糖尿病斑马鱼体内发生了糖脂代谢紊乱，从而使斑马鱼二型糖尿病模型构建的评价体系更为完善。为以后使用斑马鱼二型糖尿病模型对二型糖尿病进行进一步研究以及探索新的治疗手段提供基础。

参考文献：

1、Comparative Analysis of the Therapeutic Effects of Amniotic Membrane and Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Type 2 Diabetes[J]. Wang, Zhifeng;Li, Haisen;Fang, Jingmeng;Wang, Xiaoyu;Dai, Shuhang;Cao, Wei;Guo, Yinhong;Li, Zhe;Zhu, Hao.Stem Cell Reviews and Reports,2022

2、Assessment of Insulin, GLUT2 and inflammatory cytokines genes expression in pancreatic β-Cells in zebrafish (Danio rario) with overfeeding diabetes induction w/o glucose[J]. Mohammadi Hassan;Eshtiaghi Radina;Gorgani Sattar;Khoramizade Mohammadreza.Journal of Diabetes & Metabolic Disorders,2021

3、Disease progression and treatment response in data-driven subgroups of type 2 diabetes compared with models based on simple clinical features: an analysis using clinical trial data[J]. John M Dennis;;Beverley M Shields;;William E Henley;;Angus G Jones;;Andrew T Hattersley.The Lancet Diabetes & Endocrinology,2019

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5、糖尿病实验动物模型的研究进展[J]. 张贤梅;江波;孙勤国.中西医结合研究,2017(02)

6、杜晓宇,刘天赐,张曼.斑马鱼二型糖尿病模型的建立[J].实验动物科学,2024,41(01):25-28.

7、高糖高脂饮食诱导的大鼠Ⅱ型糖尿病模型[J]. 倪红霞.北华大学学报(自然科学版),2006(05)

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