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治疗和降低患上与犬科动物的升高的4

萌宠菠菠乐园
2024-10-15 13:23

治疗和降低患上与犬科动物的升高的4-乙基苯基硫酸盐相关的病状的风险的组合物和方法以及鉴定有风险患上此类病状的犬科动物的方法

背景技术：

1.微生物毒素4-乙基苯基硫酸盐(4-eps)是由肠道微生物产生的代谢物。在其它微生物代谢物中，4-eps进入体循环。在犬科动物中，血液中4-eps的增加的水平与应激、焦虑、脑损伤和其它行为问题相关。4-eps的水平降低已显示出缓解应激和焦虑的症状。
2.犬科动物焦虑(焦虑)是在狗预见到威胁或可怕的情形时，对恐惧和焦虑或忧虑的应答。一些个别的狗会经历不成比例的焦虑水平。焦虑可能发展为焦虑症，并且可能导致行为问题和其它问题。一些狗会经历广泛性焦虑，在广泛性焦虑的情况下会在“正常”宠物不可能做出反应的广泛范围的情形下展示出恐惧反应。焦虑可以呈现为各种焦虑症之一的形式，如广泛性焦虑症、过度刺激焦虑、分离焦虑、幽闭、噪声恐惧症等。
3.致病因素可以包含遗传成分、产前和新生儿应激源、母婴分离、缺乏社交、陌生感或遇到刺激(或类似刺激)期间出现的以前不愉快的结果。最常见的原因是恐惧、分离和衰老。恐惧相关的焦虑可能由嘈杂的噪声、陌生的人或动物、视觉刺激、新的或陌生的环境以及特定情形等引起。年龄相关的焦虑会影响老年狗，并且可以与认知功能障碍综合征(cds)相关。分离焦虑是由于宠物在与家庭成员分离时无法找到安慰而产生的特定焦虑。大约14％的狗患有分离焦虑。一些分离焦虑可能是随着幼犬变老和成熟而产生的功能障碍性依恋的结果。在一些情况下，分离焦虑可能在涉及家庭或日常常规发生变化的情况下产生，而在其它情况下，分离焦虑与潜在焦虑状态以及如恐惧症等其它行为问题相关。
4.焦虑可能会导致破坏性行为(特别是在出口处或针对主人的财产)、痛苦嘶喊、弄脏房子、流涎、踱步、焦躁不安、无法安定、厌食以及反复性或强迫性行为。在一些情况下，焦虑可能在攻击性行为中起作用。
5.狗焦虑的常见症状包含攻击性、在房子里排尿或排便、流口水、喘息、破坏性行为、抑郁、过度吠叫、踱步、焦躁不安以及反复性或强迫性行为。在患上焦虑时，不同的狗会表现出不同的症状和症状的组合。
6.犬科动物应激是狗对要求其改变或适应的需要做出的应答，通常表现为紧张感或压力感。经历应激的狗可能会产生恐惧、焦虑、多动、紧张不安、过度敏感或易怒的感觉。消极应激、过度应激和慢性应激可能对行为、健康和整体幸福感具有有害影响。应激有可能引发疾病、抑制免疫系统、导致不期望的行为，并且可能增加觉醒，所述觉醒会增加攻击性行为的概率。
7.狗的应激的原因包含悲伤、暴露于冲突、过度或不充分的刺激、过度拥挤的条件、环境变化(时间安排、人、动物、噪声增加)；惩罚性训练、社交时间不充足、可怕的事件、忽视、沮丧和不确定性等。
8.狗以不同方式传达其正在经历应激。狗正在经历应激的一些迹象包含瞳孔放大、眼睛周围紧绷、鲸鱼眼/半月眼、打哈欠、舔嘴唇/鼻子、喘息、过多流涎、微笑、牙齿打颤、脸颊肿胀、露出牙齿、皱起嘴角、耳朵向后贴或竖起。其它迹象包含身体绷紧、伸展、过度脱毛、
很少移动或不移动、低身体姿态、重心后移、颤抖/摇晃、阴茎着冠、爪子出汗、眉头紧皱、吠叫、咆哮、嚎叫和哀鸣。当受到应激时，狗的行为通常将发生变化。通常为应激诱导的常见行为包含焦躁不安、不充足或过度睡眠、跳动/过度紧张、易怒、过度自己理毛、破坏性行为、丧失食欲、偏执性/强迫性行为、无法集中、多动、排尿或排便增加以及呕吐和腹泻等。
9.单核苷酸多态性(snp)是遗传变异的常见类型。snp是特定基因座处的单碱基对突变。也就是说，snp是dna序列中的单个核苷酸的差异，其存在于基因组中的特定位置处。通常，对于特定位置处的snp而言，有两种可能的核苷酸变异，其被称为所述位置的等位基因。在群体内，基因组中的特定碱基位置处最常出现的核苷酸变异被称为主要等位基因；而所述特定碱基位置处不太常见的核苷酸变异被称为次要等位基因。与大多数多细胞生物体一样，狗具有两组染色体。因此，每只狗的每个基因或基因座都有两个拷贝，并且因此每个snp有两个拷贝。因此，对于狗的基因组中的每个snp，狗可以具有主要等位基因的两个拷贝，即一个次要等位基因和一个次要等位基因或两个次要等位基因。
10.snp可以充当生物标志物。snp可以有助于预测药物应答和患上特定疾病的风险。snp基因分型是指检测基因组内的snp。有多种用于检测snp和进行snp基因分型的方法。
11.需要开发改进的用于鉴定发生焦虑和应激的可能性或风险增加的狗的方法，降低犬科动物焦虑和应激的风险的方法以及治疗犬科动物焦虑和应激的方法。需要用于降低犬科动物体内的升高的4-eps水平的方法和组合物。需要用于治疗或降低升高水平的犬科动物焦虑的严重程度的方法和组合物。需要用于治疗或降低升高水平的犬科动物应激的严重程度的方法和组合物。

技术实现要素：

12.提供了包括分析从犬科动物受试者获得的生物样品存在犬科动物受试者体内的单核苷酸多态性bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的方法。
13.单核苷酸多态性bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在表明，所述犬科动物受试者在其一生中发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的可能性增加、发生犬科动物应激的可能性增加、发生犬科动物焦虑的可能性增加和/或发生抑制有益微生物的生长和促进有害微生物的生长的可能性增加。
14.所述方法可以包括通过进行dna测序、限制性酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应分析从所述犬科动物受试者获得的生物样品。
15.所述方法可以包括通过进行至少一种选自以下的核酸分析技术分析从所述犬科动物受试者获得的生物样品：使用全基因组snp芯片进行的分析、单链构象多态性(sscp)测定、限制性片段长度多态性(rflp)、自动荧光测序、钳位变性凝胶电泳(cdge)、变性梯度凝胶电泳(dgge)、迁移率变动分析、限制性酶分析、异源双链分析、化学错配切割(cmc)、rna酶保护测定、识别核苷酸错配的多肽的使用、等位基因特异性pcr、序列分析和snp基因分型。
16.所述方法可以包括通过进行至少一种选自以下的核酸分析技术分析从所述犬科动物受试者获得的生物样品：基于杂交的方法、基于酶的方法、基于dna的物理性质的扩增后方法以及测序方法。
17.所述方法可以包括通过进行至少一种选自以下的酸分析技术分析从所述犬科动物受试者获得的生物样品：基于杂交的方法，所述基于杂交的方法选自由以下组成的组：动
态等位基因特异性杂交、分子信标方法和snp微阵列；基于酶的方法，所述基于酶的方法选自由以下组成的组：限制性片段长度多态性(rflp)、基于pcr的方法、瓣状核酸内切酶、引物延伸方法、5'-核酸酶和寡核苷酸连接测定；基于dna的物理性质的扩增后方法，所述基于dna的物理性质的扩增后方法选自由以下组成的组：单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、高分辨率扩增子熔解、dna错配结合性蛋白、snplex和surveyor核酸酶测定；以及测序方法。
18.预防或降低犬科动物受试者的升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的方法，所述方法包括检测来自所述犬科动物受试者的生物样品中bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在，以及向所述犬科动物受试者施用包括有效量的番茄渣的组合物，如通过向所述犬科动物受试者饲喂包括有效量的番茄渣的营养组合物。
19.针对犬科动物受试者的犬科动物焦虑或犬科动物应激治疗犬科动物受试者的方法，所述方法包括检测来自所述犬科动物受试者的生物样品中bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在，以及向所述犬科动物受试者施用包括有效量的番茄渣的组合物，如通过向所述犬科动物受试者饲喂包括有效量的番茄渣的营养组合物。
20.提供了一种犬科动物食品组合物，其包括按干物质计一定量的番茄渣，所述量相当于0.087％到0.21％。
21.提供了一种犬科动物食品组合物，其包括按干物质计一定量的番茄渣，所述量相当于0.14％。
附图说明
22.图1示出了使用在实例2中生成的数据进行的匹配对分析。图1示出了每只狗的4-eps的水平在含有番茄渣的饮食(对照)与不含番茄渣的饮食(测试)方面的比较。结果显示，相较于在向狗饲喂含有番茄渣的对照食品饮食时观察到的4-eps水平，在向狗饲喂不含番茄渣的测试食品饮食时，所述狗具有更高的4-eps水平(p＝0.04)。
具体实施方式
23.以下对优选实施例的描述在本质上仅是示例性的，并且决不意图限制本发明、本发明的应用或用途。
24.除非上下文另有明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。
25.如本文所用，术语“伴侣动物”包含适于作为人类的宠物饲养的任何非人类动物，包含但不限于狗、猫、兔子和啮齿动物。具体实施例为治疗狗和/或猫的调配物和方法。在一个具体方面，本发明涉及治疗狗的调配物和方法。
26.术语“狗”包含那些作为伴侣动物的狗，如家犬、工作狗等。术语狗与术语犬科动物同义。
27.术语“猫”包含那些作为被称为家猫、或屋猫或家养猫(felis domesticus)的伴侣动物的猫。术语猫与术语猫科动物同义。
28.提供了治疗动物，具体地，如犬科动物或猫科动物等伴侣动物的焦虑和应激的方法。所述方法包括以有效量向所述动物施用有效量的番茄渣的组合。所述组合物包括有效
量的番茄渣。番茄渣的所述有效量为每日营养摄入的0.044％到0.42％，并且在一些实施例中为每日营养摄入的0.066％到0.315％，并且在一些实施例中，为每日营养摄入的0.087％-0.21％，并且在一些实施例中为每日营养摄入的0.14％。
[0029]“每日营养摄入”和“每天总体营养摄入”是指每天干物质摄入。也就是说，在计算每天消耗的营养的量时水重量不包含在内。在食品和食品成分含有水/水分的程度上，干物质表示样品中除了水以外的所有物质，包含蛋白质、纤维、脂肪、矿物质等。干物质重量是总重量减去任何水的重量。每天干物质摄入按不包括所有水的每天总体营养摄入计算。例如，相当于每日营养摄入的特定百分比的成分的量是指呈干物质形式(即不包括所有水分)的所述成分相对于一天中消耗的干物质(也不包括所有水分)的总量的量。本领域的技术人员将容易识别和理解以干物质量、干物质重量和干物质百分比表示的营养量和百分比。由于食品，无论是湿的、潮湿的还是干的，通常都含有某种量的水，所以在计算每日干物质摄入时，将此类食品的水组分排除在外。为了计算总体每日营养摄入，即每天干物质摄入，将水排除在外。为了计算以干物质计总体每日摄入的成分的百分比，从总体摄入中去除水，以得到总体每日干物质摄入，并且所述成分的百分比按以干物质形式存在的成分的量计。
[0030]
可用于所述方法的组合物可以是宠物食品组合物，如狗食品组合物。可替代地，番茄渣可以以补充剂、零食或玩具的形式施用或者可以以其它方式不掺入到提供给动物以供每日营养摄入的食品中。
[0031]
在一些优选实施例中，动物是犬科动物，并且方法包括每日向犬科动物施用有效量的番茄渣。每天向犬科动物施用的番茄渣的有效量为每日营养摄入的0.044％到0.42％，并且在一些实施例中为每日营养摄入的0.066％到0.315％，并且在一些实施例中，为每日营养摄入的0.087％-0.21％，并且在一些实施例中为每日营养摄入的0.14％。
[0032]
提供了用于治疗动物，具体地如犬科动物科或猫科动物等伴侣动物的焦虑或应激的组合物和方法。所述组合物和方法可用于治疗此类有需要的动物的焦虑或应激的症状。所述组合物和方法可用于治疗具有升高的4-eps水平的动物的焦虑或应激的症状。所述组合物和方法可用于降低具有升高的4-eps水平的动物，如伴侣动物，具体地犬科动物的升高的4-eps水平。在一些实施例中，用于治疗犬科动物的犬科动物焦虑或犬科动物应激的组合物和方法。
[0033]
如本文所用，术语“治疗”是指消除一种或多种症状、减轻一种或多种症状的严重程度或预防一种或多种症状。
[0034]
如本文所用，术语“焦虑”是指焦虑、焦虑症以及焦虑和焦虑症的症状。
[0035]
如本文所用，术语“应激”是指应激、应激症以及应激和应激症的症状。
[0036]
如本文所用，关于焦虑的术语“治疗”是指治疗性和/或预防性活动。在具有焦虑的症状的犬科动物中，治疗犬科动物焦虑是指消除症状、阻止或减少症状的进展、降低症状的严重程度和预防症状。最初消除、阻止、减少症状的进展或降低症状的严重程度的治疗可以持续，并且持续治疗可以进一步消除、阻止、减少症状的进展或降低症状的严重程度和/或预防症状的复发或发展或降低症状进一步发展的严重程度。在一些实施例中，在治疗犬科动物焦虑之前，可以将犬科动物鉴定为具有焦虑的症状。在一些实施例中，可以在不在治疗前鉴定焦虑的症状的情况下对犬科动物的焦虑进行治疗。在一些实施例中，在治疗焦虑之前，可以将犬科动物鉴定为易于患有或发生焦虑。在一些实施例中，在治疗焦虑之前，可以
将犬科动物鉴定为具有升高的4-eps水平。
[0037]
如本文所用，关于应激和应激症的术语“治疗”是指治疗性和/或预防性活动。在具有应激或应激症的症状的犬科动物中，治疗犬科动物应激是指消除症状、阻止或减少症状的进展、降低症状的严重程度和预防症状。最初消除、阻止、减少症状的进展或降低症状的严重程度的治疗可以持续，并且持续治疗可以进一步消除、阻止、减少症状的进展或降低症状的严重程度和/或预防症状的复发或发展或降低症状进一步发展的严重程度。在一些实施例中，在治疗犬科动物应激之前，可以将犬科动物鉴定为具有应激或应激症的症状。在一些实施例中，可以在不在治疗前鉴定焦虑的症状的情况下治疗犬科动物的应激或应激症。在一些实施例中，在治疗应激或应激症之前，可以将犬科动物鉴定为易于患有或发生应激或应激症。在一些实施例中，在治疗应激或应激症之前，可以将犬科动物鉴定为具有升高的4-eps水平。
[0038]
如本文所用，关于促进有益微生物生长和抑制有害微生物生长的术语“治疗”是指治疗性和/或预防性活动。在具有降低的有益微生物水平和升高的有害微生物水平的犬科动物中，用于阻止有益微生物和有害微生物的水平或促进有益微生物生长并抑制有害微生物生长的治疗。在开始治疗之前，被鉴定为易于抑制有益微生物生长并且促进有害微生物生长的犬科动物。最初促进具有升高的有害微生物水平和降低的有益微生物水平的动物的有益微生物生长并抑制有害微生物生长的治疗将有益微生物水平提高并且将有害微生物水平降低到更健康的平衡，并且此后持续治疗维持水平。在一些实施例中，在治疗犬科动物应激之前，可以将犬科动物鉴定为具有升高的有害微生物水平和降低的有益微生物水平。在一些实施例中，可以在不鉴定动物的升高的有害微生物水平和降低的有益微生物水平的情况下治疗犬科动物。
[0039]
如本文所用，术语“治疗升高的4-eps(treatment of elevated 4-eps)”、“治疗升高的4-eps(treating for elevated 4-eps)”和“治疗升高的4-eps(treating elevated 4-eps)”是指4-eps水平降低的治疗性和/或预防性活动。在具有升高的4-eps水平的犬科动物中，“治疗升高的4-eps(treatment of elevated 4-eps)”、“治疗升高的4-eps(treating for elevated 4-eps)”和“治疗升高的4-eps(treating elevated 4-eps)”是指降低升高的4-eps水平。治疗可以将升高的4-eps水平降低到正常未升高水平或降低到降低的升高的4-eps水平。在降低升高的4-eps水平后，治疗可以预防4-eps水平升高或降低升高的4-eps水平进一步发展的严重程度。在不具有升高的4-eps水平的犬科动物中，“治疗升高的4-eps(treatment of elevated 4-eps)”、“治疗升高的4-eps(treating for elevated 4-eps)”和“治疗升高的4-eps(treating elevated 4-eps)”是指阻止或降低4-eps水平，并且预防升高的4-eps水平的发展或降低升高的4-eps水平发展的严重程度。在一些实施例中，在治疗4-eps之前，可以通过测量4-eps水平来将犬科动物鉴定为具有升高的4-eps水平。在一些实施例中，可以在不在治疗前测量4-eps水平的情况下，治疗犬科动物的升高的4-eps。在一些实施例中，在治疗4-eps之前，可以将犬科动物鉴定为易于具有升高的4-eps。被鉴定为易于具有升高的4-eps的犬科动物在治疗时可以具有升高的4-eps，在这种情况下，所述治疗是治疗性的，或者可以不具有升高的4-eps，在这种情况下，治疗是预防性的，或者治疗可以在不确定4-eps水平的情况下进行。在一些情况下，可以在开始治疗之前测量或不测量4-eps水平的情况下将犬科动物鉴定为易于具有升高的4-eps。
[0040]
如本文所用，“有效的量(an amount effective)”、“有效量(an effective amount)”等类似术语是指番茄渣的有效实现特定生物学结果，即治疗升高的4-eps水平、焦虑、应激以及微生物组中的有益微生物和有害微生物的水平的量。在具体实施例中，施用有效量的组合物将持续足以影响治疗的时间。在一特定实施例中，方法包括施用并消耗包括番茄渣的组合物持续足以产生有效治疗和维持的时间段内。有效量可以基于几个因素，包含狗的理想体重、年龄、性别、活动水平、组合物的可代谢能量和饲喂组合物的频率，例如每日一次、两次或三次，以及向狗饲喂的其它组合物。在一些实施例中，有效量是指基于总体营养摄入如此施用的番茄渣的量，所述番茄渣的量相当于每天总体营养摄入的0.087％-0.21％。在一些实施例中，有效量是指包括0.087％-0.21％番茄渣的宠物食品。在一些实施例中，有效量是指基于总体营养摄入如此施用的番茄渣的量，所述番茄渣的量相当于每天总体营养摄入的0.14％。在一些实施例中，有效量是指包括0.14％番茄渣的宠物食品。
[0041]
在一些实施例中，“食品”、“食品组合物”或“宠物食品组合物”可以是对所饲喂的动物，如狗，来说营养全面的饮食。
[0042]
如本文所用，“成分”是指组合物的任何组分。
[0043]
术语“营养物”是指提供营养的物质。在一些情况下，成分可以包括多于一种“营养物”，例如，组合物可以包括玉米，所述玉米包括包含蛋白质和碳水化合物两者的重要的营养物。
[0044]
食品组合物可以以宠物食品的形式提供给动物，例如但不限于宠物。多种通常已知类型的宠物食品可供狗拥有者选择。宠物食品的选择包含但不限于湿宠物食品、半湿润宠物食品、干宠物食品和宠物零食。湿宠物食品的水分含量通常大于约65％。半湿润宠物食品的水分含量通常介于约20％与约65％之间，并且可以包含保湿剂、山梨酸钾和用于预防微生物生长(细菌和霉菌)的其它成分。如但不限于食品粗磨粒的干宠物食品的水分含量通常低于约15％。宠物零食通常可以是半湿润的可咀嚼零食；任何多种形式的干零食；可咀嚼的骨头或烘焙、挤压或冲压的零食；糖果零食；或本领域的技术人员已知的其它种类的零食。
[0045]
如本文所用，术语“粗磨粒”或“食品粗磨粒”是指如狗饲料和猫饲料等动物饲料的微粒团粒状组分。在一些实施例中，食品粗磨粒的水分或水含量少于15重量％。食品粗磨粒的质地可从硬到软变化。食品粗磨粒的内部结构可从膨胀到致密变化。食品粗磨粒可以通过挤出工艺或烘焙工艺形成。在非限制性实例中，食品粗磨粒可以具有均匀的内部结构或变化的内部结构。例如，食品粗磨粒可以包含芯和涂层以形成被涂覆的粗磨粒。应当理解，当使用术语“粗磨粒”或“食品粗磨粒”时，其可指未涂覆的粗磨粒或被涂覆的粗磨粒。
[0046]
如本文所用，术语“挤出”或“挤压”是指通过挤出机送出预处理和/或预制备的成分混合物的工艺。在挤出的一些实施例中，通过挤出工艺形成食品粗磨粒，其中可以在热和压力下挤出粗磨粒生面团，包含湿润成分和干成分的混合物，以形成食品粗磨粒。可以使用任何类型的挤出机，所述挤出机的实例包含但不限于单螺杆挤出机和双螺杆挤出机。列出了如下文描述的源、成分和组分的列表，使得其组合和混合物也是可以想到的并且在本文的范围内。
[0047]
如本文所设想的，组合物旨在涵盖但不限于营养全面且均衡的动物食品组合物。“营养全面的饮食”是包含在饮食方面足以维持健康狗的正常健康的营养物的饮食。例如对
于犬科动物来说营养全面且均衡的宠物食品组合物是本领域的技术人员所熟知的。例如，营养物等物质和适于营养全面且均衡的动物饲料组合物的成分以及其推荐量可以在，例如，佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会(aafco)的官方出版物(2012)中找到。
[0048]
设想了，在向狗饲喂包括有效量的番茄渣的饮食时，优选方法包括向狗饲喂含有番茄渣作为成分的宠物食品。在其它实施例中，向狗饲喂包括有效量的番茄渣的饮食通过向狗饲喂呈补充剂或零食形式的番茄渣来实现。无论是以宠物食品组合物的形式还是以单独补充剂或以零食的形式递送，通过任何方式向狗提供番茄渣都被视为向狗饲喂包括有效量的番茄渣的饮食。
[0049]
如本文所用，术语“补充剂”包含但不限于与另一种饲料一起使用以改善动物的总体饮食的营养均衡或性能的饲料。补充剂包含但不限于，以其它饲料的补充剂的形式饲喂不加稀释，提供了可单独获得或用动物的常规饲料稀释或与所述常规饲料混合以产生完整饲料的动物的配给的其它部分的自由选择的组合物。aafco指南例如含有与佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会(aafco)的官方出版物(2012)中的补充剂相关的讨论。补充剂可以呈各种形式，包含例如粉末、液体、糖浆、药丸、包封组合物等。
[0050]
饮食可以包括有效降低犬科动物的升高的4-eps水平的量的番茄渣。包括番茄渣的饮食可用于治疗犬科动物的焦虑。包括番茄渣的饮食可用于治疗犬科动物的应激。包括番茄渣的饮食可用于促进犬科动物受试者的微生物组，具体地胃肠道中的微生物组的有益微生物生长并抑制有害微生物生长。
[0051]
升高的4-eps的遗传易感性
[0052]
遗传关联研究揭示了可以用于将狗鉴定为易于发生升高的4-eps水平的遗传标志物。所述遗传标志物为位于来自chr14:43309715处的nod1基因上游的snp，使用canfam3.1参考基因组在商业化因美纳公司犬科动物基因分型阵列(illumina canine genotyping array)上被称为bicf2p1175095。snp bicf2p1175095的次要等位基因纯合的狗易于发生升高的4-eps水平。snp bicf2p1175095的次要等位基因是c。狗具有39对染色体。snp bicf2p1175095的次要等位基因纯合的狗具有存在于染色体14对的两个染色体14中的每个染色体上的次要等位基因。次要等位基因纯合的狗据称具有纯合型次要等位基因基因型，即snp bicf2p1175095的基因型cc或如本文所用的基因型cc。具有cc基因型的狗发生升高的4-eps水平、犬科动物焦虑和犬科动物应激的可能性有所增加。除了使犬科动物易于发生升高的4-eps水平、焦虑和应激外，狗的抑制犬科动物受试者的微生物组，具体地胃肠道的微生物组中的有益微生物生长并且促进犬科动物受试者的微生物组，具体地胃肠道的微生物组中有害微生物生长的可能性升高的cc基因型。
[0053]
被鉴定为易于发生升高的4-eps水平的狗，如将所述狗鉴定为具有cc基因型，可以通过包括有效量的番茄渣的饮食进行治疗。
[0054]
鉴定犬科动物受试者的cc基因型将所述犬科动物受试者鉴定为易于发生升高的4-eps水平。鉴定犬科动物的cc基因型将所述犬科动物鉴定为易于发生焦虑。鉴定犬科动物的cc基因型将所述犬科动物鉴定为易于发生应激。鉴定犬科动物的cc基因型将所述犬科动物鉴定为易于抑制有益微生物生长，并由此降低犬科动物受试者的微生物组，具体地胃肠道的微生物组中的有益微生物水平，并且鉴定为易于促进有害微生物生长并由此增加犬科动物受试者的微生物组，具体地胃肠道的微生物组中的有害微生物水平。
[0055]
包括有效降低犬科动物的升高的4-eps水平的量的番茄渣的饮食特别有益于已经具有cc基因型并且相应地易于具有升高的4-eps水平的犬科动物受试者。包括有效量的番茄渣的饮食特别有益于已经具有cc基因型并且相应地易于经历焦虑的犬科动物受试者。包括有效量的番茄渣的饮食特别有益于已经具有cc基因型并且相应地易于经历应激的犬科动物受试者。有效量的包括有效量的番茄渣的饮食特别有益于已经具有cc基因型并且相应地易于抑制犬科动物受试者的微生物组，具体地胃肠道的微生物组中的有益微生物生长并促进有害微生物生长的犬科动物受试者。
[0056]
不受任何特定理论的限制，位于来自nod1基因上游的bicf2p1175095的cc基因型可能导致犬科动物的胃肠道中有利于有害微生物生长而非有益微生物生长的状况。因此，犬科动物的胃肠道的微生物组中的有益微生物生长受到抑制，并且犬科动物的胃肠道的微生物组中的有害微生物生长得到促进，这导致有益微生物水平下降并且有害微生物水平增加。微生物组的有害微生物释放代谢毒素4-eps，从而使犬科动物的循环4-eps的水平升高。犬科动物的循环4-eps的水平升高可能导致狗发生焦虑和/或应激。包括有效量的番茄渣的饮食可以使犬科动物的微生物组中的有益微生物水平增加，并且使有害微生物水平降低。犬科动物的微生物组中的有益微生物水平的增加和有害微生物水平的降低使释放到循环中的4-eps更少，由此降低4-eps水平。
[0057]
鉴定易于具有升高的4-eps水平的犬科动物受试者的方法包括确定所述犬科动物受试者具有cc基因型。鉴定易于发生焦虑的犬科动物受试者的方法包括确定所述犬科动物受试者具有cc基因型。鉴定易于发生应激的犬科动物受试者的方法包括确定所述犬科动物受试者具有cc基因型。鉴定易于抑制微生物组，具体地胃肠道中的微生物组中的有益微生物生长并促进有害微生物生长的犬科动物受试者的方法包括确定所述犬科动物受试者具有cc基因型。
[0058]
降低犬科动物受试者的升高的4-eps水平并预防升高的4-eps水平或降低升高的4-eps水平的严重程度的方法包括向犬科动物受试者饲喂包括有效降低升高的4-eps水平、预防升高的4-eps水平、降低升高的4-eps水平的严重程度的量的番茄渣的饮食。在一些实施例中，降低犬科动物受试者的升高的4-eps水平并预防升高的4-eps水平或降低升高的4-eps水平的严重程度的方法包括将犬科动物受试者鉴定为具有cc基因型，以及向犬科动物受试者饲喂包括有效降低升高的4-eps水平、预防升高的4-eps水平、降低升高的4-eps水平的严重程度的量的番茄渣的饮食。
[0059]
缓解、减少和/或预防犬科动物受试者的焦虑的方法包括向犬科动物受试者饲喂包括有效缓解、减少和/或预防犬科动物的焦虑以及焦虑症的症状的量的番茄渣的饮食。在一些实施例中，缓解、减少和/或预防犬科动物受试者的焦虑的方法包括将犬科动物受试者鉴定为具有cc基因型，以及向犬科动物受试者饲喂包括有效缓解、减少和/或预防犬科动物的焦虑的量的番茄渣的饮食。
[0060]
缓解、减少和/或预防犬科动物受试者的应激的方法包括向犬科动物受试者饲喂包括有效缓解、减少和/或预防犬科动物的应激的量的番茄渣的饮食。在一些实施例中，缓解、减少和/或预防犬科动物受试者的应激的方法包括将犬科动物受试者鉴定为具有cc基因型，以及向犬科动物受试者饲喂包括有效缓解、减少和/或预防犬科动物的应激的量的番茄渣的饮食。
[0061]
促进犬科动物受试者的有益微生物生长并抑制有害微生物生长的方法包括向所述犬科动物受试者饲喂包括有效量番茄渣的饮食以促进有益微生物生长并抑制有害微生物生长。在一些实施例中，促进犬科动物受试者的有益微生物生长并抑制有害微生物生长的方法包括将所述犬科动物受试者鉴定为具有cc基因型，以及向所述犬科动物受试者饲喂包括有效量番茄渣的饮食以促进有益微生物生长并抑制有害微生物生长。
[0062]
方法包括分析从犬科动物受试者获得的生物样品的其位于如在canfam3.1参考基因组中提到的chr14:43309715处的单核苷酸多态性的次要等位基因c的2个拷贝的存在。所述snp在商业化因美纳公司犬科动物基因分型阵列上被命名为bicf2p1175095。也就是说，方法包括分析从犬科动物受试者获得的生物样品的cc基因型的存在。在一些实施例中，通过进行dna测序、限制性酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应分析样品。
[0063]
具有位于存在的chr14:43309715(bicf2p1175095)处的snp的次要等位基因c的2个拷贝的犬科动物受试者，即具有cc基因型的犬科动物受试者，在其一生中易于发生升高的4-eps水平。cc基因型表明，犬科动物受试者在其一生中易于发生焦虑，犬科动物受试者在其一生中易于发生应激，并且犬科动物受试者易于发生抑制其微生物组中的有益微生物生长并促进有害微生物生长。
[0064]
发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的可能性增加表明发生犬科动物焦虑的可能性增加，发生犬科动物应激的可能性增加和/或抑制有益微生物生长并促进有害微生物生长的可能性增加。将犬科动物鉴定为发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的可能性增加的方法是将犬科动物鉴定为发生犬科动物焦虑的可能性增加，发生犬科动物应激的可能性增加和/或抑制有益微生物生长并促进有害微生物生长的可能性增加。
[0065]
在表现出犬科动物应激或犬科动物焦虑的症状的犬科动物中，本文提供的包括分析从犬科动物受试者获得的生物样品的其位于如在canfam3.1参考基因组中提到的chr14:43309715处的单核苷酸多态性的次要等位基因c的2个拷贝的存在的方法，作为将犬科动物诊断为具有发生犬科动物应激或犬科动物焦虑的遗传易感性的方法的一部分。
[0066]
将犬科动物体鉴定为发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的可能性增加的方法表明，发生犬科动物焦虑的可能性增加，发生犬科动物应激的可能性增加和/或抑制有益微生物生长并促进有害微生物生长的可能性增加，所述方法包括分析从犬科动物受试者获得的生物样品的其位于如在canfam3.1参考基因组中提到的chr14:43309715处的单核苷酸多态性的次要等位基因c的2个拷贝的存在可以是用于治疗犬科动物以预防或降低升高的4-乙基苯基硫酸盐水平，以预防或缓解犬科动物焦虑的症状，以预防或缓解发生犬科动物应激的可能性增加的症状和/或预防或减少对有益微生物生长的抑制和对有害微生物生长的促进的方法的一部分。
[0067]
将犬科动物体鉴定为具有发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平，发生犬科动物焦虑，发生犬科动物应激的遗传易感性和/或抑制有益微生物生长并促进有害微生物生长的可能性增加的包括分析从表现出犬科动物应激或犬科动物焦虑的症状的犬科动物受试者获得的生物样品的其位于如在canfam3.1参考基因组中提到的chr14:43309715处的单核苷酸多态性的次要等位基因c的2个拷贝的存在的方法可以是用于治疗犬科动物以降低升高的4-乙基苯基硫酸盐水平，以缓解犬科动物焦虑的症状，以缓解发生犬科动物应激的可能
性增加的症状和/或预防或减少对有益微生物生长的抑制和对有害微生物生长的促进的方法的一部分。
[0068]
单核苷酸多态性bicf2p1175095
[0069]
如以上指出的，snp bicf2p1175095位于染色体14，即canfam3.1参考基因组中的位置43309715(chr14:43309715)处。seq id no:1为201个核苷酸，并且示出了包含snp bicf2p1175095(chr14:43309715)以及snp上游侧翼的100个核苷酸和下游侧翼的100个核苷酸的序列。seq id no:1的位置101为snp的位置；次要等位基因为c，并且主要等位基因是a，其被示出为[c/a]。
[0070]
seq id no:1——201个核苷酸：
[0071][0072]
可以以多种方式访问含有所公开的snp的基因组序列。一种方式是参考在《ftp://webdata2:webdata2@ussdftp.illumina.com/downloads/productfiles/caninehd/caninehd_b.csv》处找到的因美纳犬科动物hd注释文件。另外，由狗考基因组canfam3.1所定义的snp的染色体和定位为chr14:43309715。本领域的技术人员可以使用可公开获得的接口，如加利福尼亚大学圣克鲁斯基因组浏览器(university of california santa cruz genome browser)来定位所关注的snp，并且使用基因组浏览器工具提取侧翼dna序列。此外，狗参考基因组可从许多来源公开获得，如《ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-94/fasta/canis_familiaris/dna/》或《http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/canfam3/bigzips/》或《ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/gca/000/002/285/gca_000002285.2_canfam3.1》。这些数据库可用于提取相关dna序列。
[0073]
提供了检测与犬科动物受试者发生升高的4-eps水平的可能性增加相关的cc基因型的方法。提供了鉴定发生焦虑、应激以及降低的有益微生物水平和增加的有害微生物水平的风险增加的狗的方法。
[0074]
在一些实施例中，样品是基因组dna样品。在一些实施例中，样品从犬科动物受试者的血液、唾液、毛囊根、鼻拭子或口腔拭子获得。在一些实施例中，生物样品是来自犬科动物受试者的使用可商购获得的试剂盒，如performagene pg-100口服样品收集其(宾夕法尼亚州伯利恒奥瑞许技术公司(orasure technologies,inc.,bethlehem,pa)的dna genotek)的基因组dna样品。
[0075]
在一些实施例中，方法包括检测cc基因型。也就是说，方法包括检测snp bicf2p1175095(chr14:43309715)的次要等位基因c的2个拷贝的存在。在一些实施例中，检测snp bicf2p1175095(chr14:43309715)的次要等位基因c的2个拷贝的存在包括询问来自犬科动物的dna样品的次要等位基因c和主要等位基因a的存在，以及检测次要等位基因的存在和主要等位基因a的不存在。检测次要等位基因而非主要等位基因实际上检测次要等位基因的2个拷贝的存在。
[0076]
在一些实施例中，检测snp bicf2p1175095(chr14:43309715)的次要等位基因c的2个拷贝的存在的方法包括询问来自犬科动物的dna样品的主要等位基因的存在，以及检测主要等位基因的零个拷贝。检测主要等位基因的零个拷贝实际上检测次要等位基因的2个拷贝的存在。也就是说，寻找主要等位基因并且未发现拷贝实际上检测次要等位基因的2个拷贝的存在。
[0077]
在一些实施例中，使用包含至少一种选自以下的核酸分析技术的方法检测cc基因型：dna测序、限制性酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应。
[0078]
在一些实施例中，通过进行至少一种选自由以下组成的组的核酸分析技术来检测cc基因型：使用全基因组snp芯片进行的分析；单链构象多态性(sscp)测定；限制性片段长度多态性(rflp)；自动荧光测序；钳位变性凝胶电泳(cdge)；变性梯度凝胶电泳(dgge)；迁移率变动分析；限制性酶分析；异源双链分析；化学错配切割(cmc)；rna酶保护测定；识别核苷酸错配的多肽的使用；等位基因特异性pcr；序列分析；以及snp基因分型。
[0079]
在一些实施例中，使用选自由以下组成的各种类型的方法的方法来检测cc基因型：基于杂交的方法、基于酶的方法、基于dna的物理性质的扩增后方法以及测序方法。
[0080]
在一些实施例中，使用选自由以下组成的各种类型的方法的方法来检测cc基因型：基于杂交的方法，所述基于杂交的方法选自由以下组成的组：动态等位基因特异性杂交、分子信标方法和snp微阵列；基于酶的方法，所述基于酶的方法选自由以下组成的组：限制性片段长度多态性(rflp)、基于pcr的方法、瓣状核酸内切酶、引物延伸方法、5'-核酸酶和寡核苷酸连接测定；基于dna的物理性质的扩增后方法，所述基于dna的物理性质的扩增后方法选自由以下组成的组：单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、高分辨率扩增子熔解、dna错配结合性蛋白、snplex和surveyor核酸酶测定；以及测序方法。
[0081]
在一些实施例中，使用含有包含用于询问snp的遗传标志物的遗传标志物的高密度阵列来检测cc基因型。
[0082]
在一些实施例中，使用含有用于询问snp的遗传标志物的低密度阵列来检测cc基因型。
[0083]
在一些实施例中，使用含有遗传标志物的高密度阵列来检测cc基因型。阵列的实例包含可商购获得的微阵列，如犬科动物基因组2.0阵列(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司昂飞公司(affymetrix,thermo fisher scientific,waltham,ma))、狗基因组微阵列(加利福尼亚州尔湾核心生命科技公司(core life sciences，irvine ca))、因美纳公司犬科动物hd套组(the illumina canine hd panel)和额外50,000-100,000个定制遗传标志物(snp)(因美纳公司犬科动物hd套组和额外50,000-100,000个定制遗传标志物(snp)，如定制基因分型测定(加利福尼亚州圣地亚哥因美纳公司(illumina,inc.san diego,ca))。
[0084]
在一些实施例中，在cc基因型的存在的检测中使用质谱阵列系统(massarray system)。质谱阵列系统是利用质谱法来准确测量pcr衍生的扩增子的非荧光检测平台。与终点pcr相结合的质谱法实现了通用循环条件下的高度多重化反应，以提供准确、快速且具有成本效益的分析。质谱阵列系统为使用有限的输入材料的靶向基因测试提供了独特的解决方案。
[0085]
在一些实施例中，在检测到cc基因型的检测中使用珠粒阵列技术(bead array technology)。例如，可以使用因美纳公司珠粒阵列技术和infinium hd测定(加利福尼亚州圣地亚哥因美纳公司)。在一些实施例中，珠粒阵列技术用于检测snp等位基因的存在。因美纳公司珠粒阵列技术基于在平面二氧化硅载玻片上的微孔中自组装的小二氧化硅珠粒进行。每个珠粒都覆盖有特定寡核苷酸的数十万个拷贝，所述寡核苷酸在infinium测定中用作捕获序列。在珠粒进行自组装后，专有解码过程会映射每个珠粒的定位，从而确保每一个珠粒都得到单独质量控制。这种制造过程的结果是，每个珠粒芯片(beadchip)都经历严格的测试，以确保尽可能最高质量标准。infinium测定可以扩展到无限多路复用而会不损害数据质量，这与许多替代性pcr依赖性测定不同。简单的流线型工作流程在所有产品中都是通用的，不管有多少snp被询问。同样，数据采集过程和分析相同。infinium测定方案的特点是单管样品制备和全基因组扩增，无需pcr或连接步骤，这显著减少了劳动力和样品处置错误。在使未标记的dna样品在珠粒芯片上杂交之后，两步等位基因检测提供了高调用率和准确度。选择性和特异性分两步完成。与珠粒结合的50-mer寡核苷酸的靶杂交提供了高选择性，而酶促单碱基延伸还掺入了标记的核苷酸以用于测定读数。对染色试剂进行优化以提供更高的信号，并且在红色信道与绿色信道之间提供更平衡的强度。这些特征有助于提高准确度、高调用率和具有低噪声的拷贝数数据。infinium测定对基因分型研究中的每个snp产生了双色读数(每个等位基因一种颜色)。每个双色信道a和b的强度值传达关于单个基因组基因座处的等位基因比率的信息。典型研究并入了大量样品(数千个到数万个)的值，以确保显著的统计表示。当这些值被适当归一化并绘制时，会出现不同的模式(或集群)，在所述模式中样品在所测定的基因座处具有相同基因型，表现出相似的信号谱(a值和b值)并以集群的形式聚集。对于二倍体生物体来说，双等位基因基因座预期表现出三个集群(aa、ab和bb)。基因型调用基于源自标准集群文件的信息，所述标准集群文件提供了来自代表性样品集的统计数据。这使得基因型能够通过参考针对给定基因座的已知数据的测定单一强度来调用。由于调用准确度与集群数据的质量相关，因此具有高效且稳健的聚类算法对于准确的基因分型至关重要。因美纳公司gebtrain2算法准确且高效地鉴定了基因分型样品的集群模式，并且报告了总结。
[0086]
可以使用基于杂交的方法检测snp等位基因。基于杂交的方法的实例包含动态等位基因特异性杂交、采用分子信标的方法，以及采用包含高密度寡核苷酸snp阵列或低密度寡核苷酸snp阵列的snp微阵列的方法。可以通过将互补dna探针与snp位点杂交来询问snp。在动态等位基因特异性杂交中，通过使用生物素化的引物进行的pcr反应使基因组段扩增并且与珠粒连接。然后将经扩增的产物与链霉亲和素柱连接并洗涤，以去除未生物素化的链。然后，在存在与双链dna结合时发出荧光的分子的情况下添加等位基因特异性寡核苷酸。随着温度升高直到可以确定熔解温度(tm)时测量强度。通过snp低于预期的tm来检测snp。在使用分子信标的snp检测中使用经专门工程化的单链寡核苷酸探针。寡核苷酸被设计为其中互补区位于每个端部，并且探针序列定位在所述端部之间，使得探针在其天然分离状态下呈现发夹或茎环结构。荧光团与探针的一个端部连接，荧光淬灭剂与另一端部连接。当寡核苷酸呈发夹构型并且分子不发射荧光时，荧光团与淬灭剂紧密接近。探针序列与用于测定的基因组dna互补。如果分子信标的探针序列在测定期间遇到其靶基因组dna，所述探针序列将退火并杂交。寡核苷酸将不再还原为发夹构型并将发出荧光。高密度寡核苷
酸snp阵列包括阵列排布在小芯片上的数十万个探针，从而允许同时询问许多snp。使用被设计为在几个不同定位处具有snp位点以及含有与snp等位基因的错配的几个冗余探针来询问每个snp。靶dna与这些冗余探针中的每个探针的不同量的杂交允许确定特定的纯合和杂合等位基因。
[0087]
可以使用基于酶的方法来检测cc基因型。可以采用广泛的酶，包含dna连接酶、dna聚合酶和核酸酶。基于酶的方法的实例包含基于限制性片段长度多态性(rflp)的方法、基于pcr的方法、利用瓣状核酸内切酶的方法；利用引物延伸的方法、利用5'-核酸酶的方法和包含寡核苷酸连接测定的方法。用于检测snp的rflp方法使用许多不同的限制性核酸内切酶来消化基因组样品。可以借助于通过凝胶测定确定片段长度来确定酶切割还是不切割预期限制性位点。rflp测定被设计为包含在存在或不存在snp的情况下进行切割的酶，并且可以使用片段长度的模式确定snp的存在或不存在。基于pcr的方法包含四引物扩增阻滞突变系统pcr或arms-pcr，以及多个qpcr反应。四引物扩增阻滞突变系统pcr或arms-pcr采用两对引物以使两个等位基因在一个pcr反应中扩增。引物被设计为使得两个引物对在snp定位处重叠，但每个引物与可能的snp中的仅一个snp完全匹配。可替代地，可以使用单独靶向每个等位基因的不同引物组运行多个qpcr反应。一些实施例利用瓣状核酸内切酶(fen)，所述fen是催化结构特异性切割的核酸内切酶。这种切割对错配高度敏感，并且可以用于以高度特异性询问snp。被称为切割酶的fen与两个特异性寡核苷酸探针组合，所述两个特异性寡核苷酸探针与靶dna一起可以形成切割酶所识别的三元结构。第一探针，被称为invader寡核苷酸，与靶dna的3'端互补。invader寡核苷酸的最后一个碱基是与靶dna中的snp核苷酸重叠的不匹配碱基。第二探针是等位基因特异性探针，其与靶dna的5'端互补，但还延伸超过snp核苷酸的3'侧。等位基因特异性探针将含有与snp核苷酸互补的碱基。
[0088]
引物延伸是两步过程，其首先涉及探针与紧邻snp核苷酸上游的碱基的杂交，随后为“微型测序”反应，在所述微型测序中dna聚合酶通过添加与snp核苷酸互补的碱基使杂交的引物延伸。此掺入的碱基被检测到并且确定snp等位基因。引物延伸方法用于多种测定格式。这些格式使用广泛的检测技术，所述检测技术包含maldi-tof质谱法(参见sequenom公司(sequenom))和类似elisa的方法。使用质谱阵列质谱仪的sequenom公司的iplex snp基因分型方法。引物延伸的灵活性和特异性使其适用于高通量分析。引物延伸探针可以阵列排布在载玻片上，从而允许一次对许多snp进行基因分型。被称为阵列化引物延伸(apex)，这种技术具有优于基于探针的差异杂交的方法的多种益处。
[0089]
因美纳合并公司的infinium测定是基于引物延伸方法的全基因组基因分型流水线的实例。在infinium测定中，可以对超过100,000个snp进行基因分型。所述测定在引物延伸反应中使用半抗原标记的核苷酸。半抗原标记被抗体识别，所述抗体反过来与可检测信号相关。apex-2是阵列化引物延伸基因分型方法，其能够使用高效的均相多重pcr(至多640重)和四色单碱基延伸在微阵列上并行鉴定数百个snp或突变。多重pcr需要每snp/突变两个寡核苷酸以产生含有所测试的碱基对的扩增子。利用5'-核酸酶的方法包含在taqman测定中使用taq dna聚合酶的5'-核酸酶活性进行snp基因分型的方法。taqman测定与pcr反应并行进行，并且可以随着pcr反应进行而实时读取结果。在包含寡核苷酸连接测定的方法中，寡核苷酸dna连接酶催化dna片段的3'端与直接相邻的dna片段的5'端的连接。这种机制可以用于通过使两个探针直接在snp多态性位点上杂交来询问snp，以此如果探针与靶dna
相同，则可以进行连接。用于检测snp的其它扩增后方法的实例包含基于dna的物理性质的方法。此类方法首先涉及靶dna的pcr扩增。
[0090]
检测snp等位基因的几种方法基于dna的物理性质，如熔解温度和单链构象。使用单链构象的方法基于折叠成三级结构的单链dna(ssdna)。构象是序列依赖性的，并且大多数单碱基对突变将改变结构的形状。当应用于凝胶时，三级形状将决定ssdna的迁移率，从而提供在snp等位基因之间进行区分的机制。此方法首先涉及靶dna的pcr扩增。使用热和甲醛使双链pcr产物变性以产生ssdna。将ssdna施加到非变性电泳凝胶，并且允许折叠成三级结构。dna序列的差异将改变三级构象，并且被检测为ssdna链迁移率的差异。温度梯度凝胶电泳(tgge)或温度梯度毛细管电泳(tgce)方法基于这样原理，即部分变性的dna在凝胶或其它多孔材料中受到更多的限制，并且较慢行进。在另一种方法中，变性高效液相色谱法(dhplc)使用反相hplc来询问snp。在dhplc中，对单链和双链dna具有不同亲和力的固相。使用的另一种方法是整个扩增子的高分辨率熔解。也可以使用dna错配结合性蛋白的用途来检测snp。来自水生栖热菌(thermus aquaticus)的muts蛋白以不同的亲和力与不同的单核苷酸错配结合，并且可以用于毛细管电泳以区分所有六组错配。snplex是由应用生物系统公司(applied biosystems)销售的专有基因分型平台。surveyor核酸酶测定使用surveyor核酸酶，即识别所有碱基取代和小插入/缺失(插入缺失(indel))并且切割两个dna链中的错配的位点的3'侧的错配核酸内切酶。snp检测中还可以使用测序技术。测序技术的进步使通过测序进行snp检测变得更加实际。
[0091]
通过使用下一代测序技术的测序进行基因分型已成为惯常做法。通过测序进行基因分型，也被称为gbs，是用于发现单核苷酸多态性(snp)以便进行基因分型研究，如全基因组关联研究(gwas)的方法。gbs使用限制性酶来降低基因组复杂性并对多个dna样品进行基因分型。消化后，进行pcr以增加片段池，然后使用下一代测序技术对gbs文库进行测序。随着如通过合成进行的因美纳公司短读段测序和pacbio的单分子实时测序等下一代测序技术的进步，进行gbs变得更加可行。未来，如纳米孔单分子测序等新技术的发展可以实现全基因组测序/基因分型。
[0092]
组合物和调配物
[0093]
以上概述的方法的应用已经鉴定了已组合以提供组合物、食品和饮食的生物活性饮食组分，所述组合物、食品和饮食提供对被确定为易于发生升高的4-eps水平，并且由此发生焦虑的风险增加、发生焦虑应激的风险增加并且抑制犬科动物的微生物组，具体地肠道微生物组中的有益微生物生长并且促进有害微生物生长的风险增加的狗的显著益处。
[0094]
提供了包括向狗饲喂包括量相当于每天总体营养摄入的0.044％到0.42％的番茄渣的日常饮食的方法。在一些实施例中，所提供的方法包括向狗饲喂包括量相当于每天总体营养摄入的0.066％到0.315％的番茄渣的日常饮食。在一些实施例中，所提供的方法包括向狗饲喂包括量相当于每天总体营养摄入的0.087％到0.21％的番茄渣的日常饮食。在一些实施例中，所提供的方法包括向狗饲喂包括量相当于每天总体营养摄入的0.14％的番茄渣的日常饮食。
[0095]
在一些实施例中，食品产品是用于成年犬科动物的营养全面的饮食。在一具体方面，食品产品是针对成年伴侣犬科动物调配的营养全面的饮食。
[0096]
在一些实施例中，组合物包含食品组合物，所述食品组合物可以包括有效量的番
茄渣与以下的组合：按基于干物质的组合物的总重量计量为4％到75％或更多的蛋白质，按基于干物质的组合物的总重量计量为5％到50％或更多的脂肪，以及按基于干物质的组合物的总重量计5％到75％或更多的碳水化合物，其中所述食品组合物适于狗消耗。
[0097]
本文所提供的方法中施用的组合物可以以食品组合物的形式调配，在某些实施例中，所述食品组合物是营养均衡和/或营养全面的食品产品或饮食。在其它实施例中，组合物以营养补充剂、零食或玩具的形式调配。
[0098]
在一些实施例中，例如，除了有效量的番茄渣外，营养全面且均衡的狗食品组合物可以包括：4重量％到90重量％、5重量％到75重量％、10重量％到60重量％的蛋白质以及15重量％到50重量％的蛋白质；0重量％到90重量％、2重量％到80重量％、5重量％到75重量％以及10重量％到50重量％的碳水化合物；2重量％到60重量％、5重量％到50重量％以及10重量％到35重量％的脂肪。组合物可以进一步含有0重量％到15重量％或2重量％到8重量％的维生素和矿物质、抗氧化剂以及支持动物的营养需要的其它营养物。
[0099]
适于包含在组合物中以及具体地要在本文提供的方法中施用的食品产品中的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质、平衡剂等的来源可以选自本领域的普通技术人员已知的那些常规材料。
[0100]
在一些实施例中，可用作食品组合物的成分的蛋白质可以包括：来自动物来源的蛋白质，如动物蛋白质，所述动物蛋白质包含哺乳动物、禽类蛋白质、爬行动物、两栖动物、鱼类、无脊椎动物蛋白质以及其组合；例如，来自任何牛、绵羊、猪、山羊、鹿、兔、马、袋鼠、它们的奶、凝乳、乳清或血液以及如平滑肌、横纹肌、肝脏、肾脏、肠或心脏等内部组织和器官的蛋白质；额外禽类蛋白质来源涵盖火鸡、鹅、鸭、鸵鸟、鹌鹑、鸽子、它们的蛋以及如平滑肌、横纹肌、肝脏、肾脏、肠或心脏等内部组织和器官；两栖动物来源包含青蛙或蝾螈；爬行动物蛋白质来源包含鳄鱼、蜥蜴、乌龟和蛇；鱼类蛋白质来源包含鲶鱼、鲱鱼、鲑鱼、金枪鱼、蓝鱼、鳕鱼、比目鱼、鳟鱼、剑鱼和它们的卵；并且无脊椎动物蛋白质来源包含龙虾、螃蟹、蛤蜊、贻贝或牡蛎以及其组合、肉蛋白分离物、乳清蛋白分离物、鸡蛋蛋白、其混合物等；以及来自植物来源的蛋白质，如大豆蛋白分离物、玉米麸质粉、小麦麸质、其混合物等。
[0101]
在一些实施例中，可用作食品组合物的成分的碳水化合物可以包含但不限于在水解时代谢为能量的以下中的一种或多种：玉米、全黄玉米、谷物高梁、小麦、大麦、大米、小米、酿酒大米、燕麦碎粒以及多糖(例如，淀粉和糊精)和糖(例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖)。适于包含在本文公开的组合物中的额外碳水化合物来源的实例包含水果和非番茄渣蔬菜。
[0102]
可用作食品组合物的成分的脂肪可以来自任何来源，如但不限于家禽脂肪、牛脂、猪油、精选白色油脂、大豆油、玉米油、菜籽油、葵花油、其混合物等。脂肪可以完全掺入在食品组合物内，沉积在食品组合物的外部，或两种方法的混合物。
[0103]
在一些实施例中，组合物进一步包含有效量的一种或多种选自由以下组成的组的物质：氨基葡萄糖胺、软骨素、硫酸软骨素、甲基磺酰基甲烷(“msm”)、肌酸、抗氧化剂、小管贻贝(perna canaliculata)、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸以及其混合物。
[0104]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括一种或多种氨基酸，如但不限于精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(包含dl-甲硫氨酸和l-甲硫氨酸)、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、牛磺酸、肉碱、丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨
酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和羟脯氨酸。
[0105]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括一种或多种脂肪酸，如但不限于月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、十七烷酸、十七碳一烯酸(margaroleic acid)、硬脂酸、油酸、亚油酸、g-亚麻酸、a-亚麻酸、硬脂四烯酸、花生酸、鳕油酸、dhgla、花生四烯酸、二十碳四酸、epa、山萮酸、芥酸、二十二碳四酸和dpa。
[0106]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括一种或多种常量营养物，如但不限于水分、蛋白质、脂肪、粗纤维、灰分、膳食纤维、可溶性纤维、不溶性纤维、棉子糖和水苏糖。
[0107]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括一种或多种微量营养物，如但不限于β-胡萝卜素、α-硫辛酸、葡糖胺、硫酸软骨素、番茄红素、叶黄素和槲皮素。
[0108]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括一种或多种矿物质，如但不限于钙、磷、钾、钠、氯化物、铁、铜、铜、锰、锌、碘、硒、硒、钴、硫、氟、铬、硼和草酸。
[0109]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括一种或多种其它维生素，如但不限于维生素a、维生素c、维生素d、维生素e、藜麦粒、硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、泛酸、叶酸、维生素b12、生物素和胆碱。
[0110]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括纤维，所述纤维可以由各种来源供应，所述各种来源包含例如植物纤维来源，如纤维素、甜菜浆、花生壳和大豆纤维。
[0111]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括稳定性物质，例如，倾向于增加组合物的保存期限的物质。此类物质的潜在适合的实例包含例如防腐剂、抗氧化剂、协同剂和螯合剂、包装气体、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂和湿润剂。乳化剂和/或增稠剂的实例包含例如明胶、纤维素醚、淀粉、淀粉酯、淀粉醚和改性淀粉。
[0112]
在一些实施例中，食品组合物进一步包括用于着色、适口性和营养目的的添加剂，包含例如着色剂；氧化铁、氯化钠、柠檬酸钾、氯化钾和其它食用盐；维生素；矿物质；以及调味品。组合物中此类添加剂的量通常为至多5％(组合物的干基)。
[0113]
组合物的制备
[0114]
包括番茄渣的组合物可以以适于狗消耗的食品产品的形式制备。这些食品可以具有任何稠度或水分含量；即，组合物可以是湿润、半湿润或干食品产品。“湿润”食品产品通常是水分含量为60％到90％或更大的那些食品产品。“干”食品产品通常是水分含量为3％到11％的那些食品产品，并且通常以小块或粗磨粒的形式制造。“半湿润”食品产品的水分含量通常为25％到35％。食品产品还可以包含多于一种稠度的组分，例如柔软、可咀嚼的肉样颗粒或块以及具有外部谷物组分或涂层和内部“乳状”组分的粗磨粒。
[0115]
在一些实施例中，包括番茄渣的食品产品可以使用本领域的普通技术人员已知的常规食品制备方法以罐装或湿形式制备。通常，将研磨过的动物蛋白质组织与其它成分，如谷类谷物、合适的碳水化合物来源、脂肪、油和平衡成分，包含如维生素和矿物质混合物、无机盐、纤维素和甜菜浆等特殊目的添加剂以及水以足以进行加工的量混合。将成分在适于加热同时将组分共混的容器中混合。加热混合物使用任何合适的方式进行，例如直接蒸汽喷射或使用装配有热交换器的容器。在添加调配物的所有成分后，将混合物加热到50℉到212℉的温度。尽管可以使用超出此范围的温度，但如果不使用其它加工助剂，其在商业上可能是不实际的。当加热到适当温度时，材料通常会呈粘稠液体的形式，所述粘稠液体被分配到罐中。施加盖并将容器气密密封。然后将经密封的罐放置在被设计为用于对内容物进
行消毒的常规设备中。杀菌通常通过加热到超过230℃的温度持续适当的时间来完成，所述适当的时间取决于所用温度、组合物的性质和相关因素。本发明的组合物和食品产品也可以在其制备之前、期间或之后添加到食品组合物或与食品组合物组合。
[0116]
在一些实施例中，食品产品可以使用本领域的普通技术人员已知的惯例方法以干形式制备。通常，将包含经干燥的动物蛋白、植物蛋白、谷物等在内的干成分研磨并混合在一起。将包含脂肪、油水、动物蛋白、水等的液体或湿润成分与干材料一起添加组合。用于将各种成分组合的特定调配、添加顺序、组合以及方法和设备可以选自本领域已知的那些。例如，在某些实施例中，将所得混合物加工成粗磨粒或类似干块，所述粗磨粒或类似干块使用挤出工艺形成，在所述挤出工艺中干成分和湿成分的混合物在高压和高温下经受机械功，被迫穿过小开口或孔口，并且例如用旋转刀切割为粗磨粒。然后可以对所得粗磨粒进行干燥并任选地涂覆一种或多种局部涂层，所述局部涂层包括例如调味剂、脂肪、油、粉末状成分等。粗磨粒也可以由面团通过烘焙而非挤出制备，其中所述面团被放置到模具中，然后进行干热加工。
[0117]
在制备组合物时，通常可以在调配物加工期间，例如，在将组合物的其它组分混合期间和/或之后，将任何成分掺入到组合物中。将这些组分分布到组合物中可以通过常规方式完成。在某些实施例中，研磨过的动物和/或家禽蛋白质组织与包含营养平衡剂、无机盐在内的其它成分混合，并且可以进一步包含维素、甜菜浆、增体剂等连同足以进行加工的水。
[0118]
在一些实施例中，所述组合物被调配为以便更容易咀嚼。在具体实施例中，组合物和食品产品被调配为解决动物的物种与品种之间以及动物的属性中的多个属性之一的特定营养差异。例如，犬科动物食品例如通常基于生命阶段、年龄、大小、体重、身体组成和品种调配。
[0119]
包括有效量的番茄渣的组合物被调配为营养全面的饮食，以满足成熟成年犬科动物的需求。包含饮食上足以维持健康动物的正常健康的营养物的这些营养全面的饮食。营养全面且均衡的宠物食品组合物，例如伴侣犬科动物的宠物食品组合物是本领域的技术人员所熟知的。例如，营养物等物质和适于营养全面且均衡的动物饲料组合物的成分以及其推荐量可以在，例如，佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会(aafco)的官方出版物(2012)中的补充剂相关的讨论。
[0120]
在另一实施例中，可以通过例如与以下针对干食品描述的那些方法类似的挤压或烘焙方法来制备包括有效量的番茄渣的零食，以提供可食用产品。零食包含，例如，提供给动物以诱使动物在非用餐时间食用的组合物。零食可以是有营养的，其中所述组合物包括一种或多种营养物并且例如可以具有如上所述用于食品的组合物。非营养性零食涵盖任何其它非毒性的零食。组合物可以涂覆到零食上、掺入到零食中或两者。
[0121]
在另一实施例中，提供了一种作为可咀嚼或可消耗的玩具的动物玩具。这类玩具通常通过向任何现有玩具涂覆有效量的番茄渣制备。因此，玩具包含例如可咀嚼玩具等。设想的针对狗的玩具包含例如人造骨头。在某些实施例中，本发明的组合物可以在玩具的表面或玩具的组分的表面上形成涂层，或者其可以部分或完全掺入到整个玩具或两者。目前市场销售各种各样合适的玩具。参见，例如，美国专利第5,339,771号(以及美国专利第5,339,771号中公开的参考文献)。还参见，例如，美国专利第5,419,283号(以及美国专利第5,
419,283号中公开的参考文献)。应当认识到，本发明设想了可部分消耗的玩具(例如，包括塑料组分的玩具)和可完全消耗的玩具(例如，生皮和各种人造骨头)两者。应进一步认识到，本发明设想了针对伴侣动物的玩具，以及具体地供猫或狗食用的玩具。
[0122]
本文所提及的所有公开案都是出于描述和公开公开案中所报告的材料和方法的目的而通过引用并入，所述材料和方法可以结合本发明一起使用。
[0123]
本发明的另外的适用领域将根据下文提供的具体实施方式而变得显而易见。当应理解，虽然具体实施方式和具体实例指示了本发明的优选实施例，但是仅旨在用于说明的目的而并非旨在限制本发明的范围。
[0124]
实例
[0125]
实例1
[0126]
收集血液以确定血浆代谢组学谱。可以由商业实验室(美国北卡罗来纳州达勒姆metabolon公司(metabolon,durham,nc,usa))测量血浆中的4-eps水平。分离所提取的上清液，并且使所述上清液在气相色谱和液相色谱质谱仪平台上运行。4-eps的峰是已知的，并且每个样品的峰下面积可以相对于已知样品归一化。(还参见：evans,a.m.等人(2009)“用于对生物系统的小分子补体进行鉴定和相对定量的集成、非靶向超高效液相色谱/电喷雾离子化串联质谱平台(integrated,nontargeted ultrahigh performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry platform for the identification and relative quantification of the small-molecule complement of biological systems.)”《分析化学(anal.chem.)》81,6656-6667)。使用气相色谱(针对疏水分子)和液相色谱(针对亲水分子)来鉴定如血浆样品中存在的4-eps等代谢物并提供对代谢物的相对定量。(还参见：ballet,c.等人(2018)“选择性研究肠道微生物群衍生代谢物的新的酶促和质谱方法(new enzymatic and mass spectrometric methodology for the selective investigation of gut microbiota-derived metabolites)”,《化学科学(chem.sci.)》9,6233-6239；akiyama,y等人(2012)“用于通过毛细管电泳与质谱(ce-ms)说明ast-120对5/6肾切除的大鼠的影响的代谢组学方法(a metabolomic approach to clarifying the effect of ast-120 on 5/6 nephrectomized rats by capillary electrophoresis with mass spectrometry(ce-ms))”,《毒素(toxins)》4(11):1309-1322；以及kikuchi k等人(2010)“通过液相色谱/串联质谱对作为口服吸附剂ast-120的效应的指示剂的尿毒症毒素进行的代谢组学研究(metabolomic search for uremic toxins as indicators of the effect of an oral sorbent ast-120by liquid chromatography/tandem mass spectrometry.)”《色谱杂志b：生物医学和生命科学中的分析技术(j chromatogr b analyt technol biomed life sci)》878:2997
–
3002)。
[0127]
实例2
[0128]
核苷酸结合性寡聚化结构域1，被称为nod1，是检测衍生自肠道菌群(intestinal microflora)的细胞壁组分的小肽的细胞内传感器，其会引起先天免疫应答。通过nod1激活做出的先天免疫应答在抵抗微生物感染的宿主防御和胃肠道病症的发展两者中均发挥作用。
[0129]
显示出在位于nod1基因的上游的snp bicf2p1175095与循环4-eps水平之间存在
关系的全基因组关联分析(gwas)。具有cc基因型的狗通过某些有益微生物引起的肠道定殖受损的风险升高。这可能导致有害微生物生长，所述有害微生物生长可以通过某些微生物代谢物进入体循环对如大脑等远端器官产生影响。已知的应激相关微生物代谢物4-eps在具有cc基因型的狗体内被检测到为9倍。
[0130]
有效量的番茄渣可以降低狗的4-eps水平。因此，番茄渣对这些具有cc基因型的狗特别有益。
[0131]
实例3
[0132]
完成了一项研究，在所述研究中将40只狗随机分配为对照组(20只狗)或测试组(20只狗)，并且使狗接受含有番茄渣的基础饮食或不具有番茄渣的食品持续30天。在一个月的洗脱期后，进行交叉以向所述组饲喂其先前未接受的食品。30天后，收集血液样品以通过代谢组学测量4-乙基苯基硫酸盐水平。因此，所有的狗都接受了具有番茄渣的食品或不具有番茄渣的食品30天，其中在每个30天饲喂时间段结束时完成代谢组学分析。
[0133]
结果显示，易于具有高4-eps的狗可以从含有特定水平的番茄渣的食品的消耗中受益。比较在消耗食品之后每只狗的4-eps的水平的匹配对分析显示出4-eps由于添加的番茄渣而显著降低(p＝0.04)(图1)。
[0134]
导致低4-eps水平的番茄渣的每日摄入在表1中指出。
[0135]
通过基于干物质的0.14％番茄渣的平均每日摄入实现了最低4-eps水平，所述平均每日摄入是按每天约172总体克数计0.24克番茄渣的当量。基于干物质的0.087％到0.21％番茄渣的相当于按每天基于干物质的约172总体克数计基于干物质的0.15克到0.35克番茄渣的每日消耗导致循环中的低4-eps水平。
[0136]
表1
[0137][0138]
当以有效量提供时，番茄渣可降低循环4-eps水平。可以通过纳入有效量的番茄渣来调配针对宠物的抗应激食品，由此降低微生物毒素4-eps的血液水平，所述水平在增加时与应激、焦虑和脑损伤相关。这种宠物食品由此解决了与宠物的升高的循环4-eps水平相关的应激相关问题。
[0139]
实例4
[0140]
从犬科动物获得唾液样品。可以在收集时将样品运送到处于另一位置的实验室，进行部分处理并随后运送到位于另一位置的实验室，或者在实验室和收集场所进行完全处理和分析。如果在收集时将样品运送到位于另一位置的实验室或进行部分处理并随后运送到位于另一位置的实验室，则可以将可以包含由实验室从样品中收集的一些或全部数据的结果传输给收集场所，和/或兽医和/或犬科动物的所有者或责任方。获得唾液样品后，可以对样品进行处理以供分析，并评估cc基因型的存在。
[0141]
如果结果表明犬科动物出现升高的4-eps水平的可能性或风险增加，则可以向所述犬科动物施用包括有效量的番茄渣的组合物。
[0142]
实例5
[0143]
使用performagene pg-100经口收集试剂盒从犬科动物收集样品。
[0144]
这样做时，动物在唾液收集前30分钟内不应进食或在10分钟内不应饮水，进行收
集的个体不应用海绵刮擦动物的牙齿或脸颊，也不应让动物咀嚼或啃咬海绵。
[0145]
作为performagene pg-100经口收集试剂盒的一部分提供的收集管含有保持dna样品并且实验室需要以分析样品的液体。在样品收集之前，不应移除盖。
[0146]
在收集方案的第一步，将海绵放置在动物的口中位于颊囊处。通过移动海绵收集唾液持续30秒，并且在唾液自然池化的地方(在颊囊和舌下)拖拭。对于大于6个月的动物，可能需要进行适度约束。
[0147]
接下来，直立固持管，将盖从管上旋开。将盖上下翻转，并将口腔拭子放置在管中。将盖旋紧，以防止液体样品在运输期间泄漏。将管倒置并剧烈摇晃多次，例如10次，以彻底混合样品。
[0148]
可以使用永久性记号笔在管标签上可用的空白处清楚地写上动物标识号。
[0149]
用于对来自已经用pg-100收集试剂盒收集并保存在performagene化学品中的performagene
tm
样品的0.5ml等分试样的dna进行手动纯化的分步实验室方案如下。手动纯化所需的试剂可通过pg-ac1试剂包或pg-ac4试剂包获得。
[0150]
收集dna样品并将样品与performagene溶液混合时，dna立即稳定化，performagene样品在室温下从收集时稳定1年。performagene样品在-15℃到-20℃下可以无限期储存，并且可以经历多个冷冻-融化循环而不会使dna劣化。
[0151]
纯化过程中使用以下设备和试剂：能够以15,000
×
g运行的微量离心机；50℃的空气或水温育箱；处于室温的乙醇(95％到100％)；dna缓冲液：te(10mm tris-hcl、1mm edta，ph 8.0)或类似溶液；可选糖原(20mg/ml)(例如，invitrogen目录号10814-010)；处于室温的乙醇(70％)和5m nacl溶液。
[0152]
在第一步中，通过剧烈摇晃5秒来混合样品。这是为了确保粘性样品与performagene溶液适当混合。
[0153]
将样品在50℃空气温育箱中温育最少2小时，或在50℃水温育箱中温育最少1小时。performagene中的dna在室温下稳定，即使没有温育步骤也是如此。此热处理步骤对于确保dna充分释放和核酸酶永久失活至关重要。此温育步骤可以在从动物中收集样品之后并且在对样品进行纯化之前的任何时间进行。建议对整个样品进行温育。如果更方便的话，可以将样品在50℃下温育过夜。在空气温育箱中需要更长时间，因为温度平衡比在水温育箱中慢。
[0154]
可选地，可以移除收集海绵。移除盖，并且将收集海绵压靠在试管内部，以尽可能提取尽可能多的样品。丢弃海绵和盖。海绵移除取决于工作流的偏好。
[0155]
接下来，将500μl经混合的performagene样品转移到1.5ml微量离心管中。可以将performagene样品的其余部分储存在室温下或冷冻(-15℃到-20℃)。然后将20μl(1/25体积)pg-l2p纯化液添加到微量离心管中并通过涡旋几秒钟来混合。随着杂质和抑制剂沉淀，样品变得浑浊。
[0156]
将样品在冰上温育10分钟(可以用室温温育代替，但室温温育在去除杂质方面将略微不太有效)，然后在室温下以15,000
×
g离心5分钟。较长时间段的离心(至多15分钟)可能有利于降低最终dna溶液的浊度(高a320)。用移液器尖端将澄清的上清液转移到新微量离心管中，并且丢弃含有混浊杂质的团粒。向500μl上清液添加25μl(1/20体积)5m nacl，然后混合。添加nacl是确保高效回收dna所必需的。向500μl上清液添加600μl室温95％到
100％乙醇，然后通过颠倒10次轻轻混合。在与乙醇混合期间，dna将沉淀。dna可以表现为dna纤维的凝块或细沉淀物，这取决于样品中dna的量。即使没有看到凝块，也将通过仔细遵循接下来的步骤回收dna。
[0157]
使样品在室温下静置10分钟以使dna完全沉淀。然后将管以已知朝向放置在离心机中(dna团粒在离心后可能不可见)，并且在室温下以》15,000
×
g离心2分钟。例如，可以将每个管放置在微型离心机中，其中盖的铰接部分指向远离转子中心。离心后，可以定位团粒的位置(即使太小而无法容易看到)；其将位于管的尖端处，处于铰接部下方。
[0158]
用移液管尖端去除上清液并丢弃。团粒含有dna。旋转管使得团粒处于上壁上将实现沿下壁安全地移动移液器尖端，并去除所有上清液。上清液可以含有杂质，并且应尽可能被完全去除。团粒过度干燥可能使dna更难以溶解。通过首先添加250μl 70％乙醇，然后使乙醇在室温下静置1分钟洗涤dna。在不扰动团粒的情况下用移液器尖端去除乙醇。70％乙醇洗涤液有助于去除残余抑制剂。然而，完全去除乙醇对于防止抑制下游应用至关重要。因此，将管离心6秒钟以使任何剩余乙醇池化，用移液器尖端去除所述剩余乙醇。
[0159]
将100μl dna缓冲液(例如te缓冲液)添加到管中以使dna团粒溶解。涡旋至少5秒有助于溶解过程。为了确保dna完全再水合，使dna在室温下静置过夜。现在可以对dna定量，并且用于下游应用。
[0160]
使用荧光染料对dna样品中的双链dna(dsdna)的量定量的测定比260nm处的吸光度更具特异性。为了通过荧光方法对dna定量，可以使用如或绿i等荧光染料来对dsdna定量，因为污染rna的干扰较小。可替代地，可以使用可商购获得的试剂盒，如英杰公司(invitrogen)的quant-it
tm picogreen dsdna测定试剂盒(目录号q-33130)。对于任一方案，优选地用te溶液1:50稀释经纯化的dna，并且在定量测定中使用5μl。
[0161]
可替代地，可以通过吸光度对dna定量，在这种情况下，经纯化的样品优选首先用rna酶进行处理以消化污染性rna，随后通过乙醇沉淀dna去除rna片段。来自performagene样品的dna通常含有比存在于血液样品中的rna多得多的rna。在读取吸光度之前，确保乙醇沉淀的dna完全溶解。260nm处的1.0的吸光度对应于对于纯dsdna的50ng/μl(50μg/ml)的浓度。应使用能够读取100μl或更少体积的分光光度计比色皿，以避免使用太大体积的样品。260nm处的吸光度值应介于0.1与1.5之间。较低值可能不可靠。
[0162]
用90μl te(1/10稀释)对经纯化的经rna酶处理的dna的10μl等分试样进行稀释，并且通过轻轻上下移液进行混合。等待气泡清除。te用于参考(空白)细胞。测量320nm、280nm和260nm处的吸光度。通过从a
280
和a
260
值中减去320nm处的吸光度(a
320
)来计算经校正的a
280
和a
260
值。以ng/μl为单位的dna浓度＝经校正的a
260
×
10(稀释因子)
×
50(转换因子)。a
260
/a
280
比率：将校正的a
260
除以经校正的a
280
。
[0163]
实例6
[0164]
使用因美纳公司珠粒芯片技术和infinium hd测定的全基因组dna测定可以用于检测cc基因型。优选的，测试是包含询问一个或多个其它临床重要的snp的套组。
[0165]
开始于包括经纯化的基因组dna(200-400ng)的样品，样品经历无pcr的全基因组扩增以产生询问snp的片段dna。要鉴定cc基因型，可以使用因美纳公司犬科动物hd套组和额外50,000-100,000个定制遗传标志物(snp)(加利福尼亚州圣地亚哥因美纳公司因美纳
公司犬科动物hd套组)。此系统可以用于询问样品的cc基因型的存在，或者可以将珠粒阵列技术定制为限制到较少snp以供筛选。
[0166]
因美纳公司珠粒阵列技术基于在平面二氧化硅载玻片上的微孔中自组装的小二氧化硅珠粒进行。每个珠粒都覆盖有特定寡核苷酸的数十万个拷贝，所述寡核苷酸在infinium测定中用作捕获序列。在珠粒进行自组装后，专有解码过程会映射每个珠粒的定位，从而确保每一个珠粒都得到单独质量控制。这种制造过程的结果是，每个珠粒芯片都经历严格的测试，以确保尽可能最高质量标准。infinium测定可以扩展到无限多路复用而会不损害数据质量，这与许多替代性pcr依赖性测定不同。简单的流线型工作流程在所有产品中都是通用的，不管有多少snp被询问。同样，数据采集过程和分析相同。infinium测定方案的特点是单管样品制备和全基因组扩增，无需pcr或连接步骤，这显著减少了劳动力和样品处置错误。在使未标记的dna样品在珠粒芯片上杂交之后，两步等位基因检测提供了高调用率和准确度。选择性和特异性分两步完成。与珠粒结合的50-mer寡核苷酸的靶杂交提供了高选择性，而酶促单碱基延伸还掺入了标记的核苷酸以用于测定读数。对染色试剂进行优化以提供更高的信号，并且在红色信道与绿色信道之间提供更平衡的强度。这些特征有助于提高准确度、高调用率和具有低噪声的拷贝数数据。infinium测定对基因分型研究中的每个snp产生了双色读数(每个等位基因一种颜色)。每个双色信道a和b的强度值传达关于单个基因组基因座处的等位基因比率的信息。典型研究并入了大量样品(数千个到数万个)的值，以确保显著的统计表示。当这些值被适当归一化并绘制时，会出现不同的模式(或集群)，在所述模式中样品在所测定的基因座处具有相同基因型，表现出相似的信号谱(a值和b值)并以集群的形式聚集。对于二倍体生物体来说，双等位基因基因座预期表现出三个集群(aa、ab和bb)。基因型调用基于源自标准集群文件的信息，所述标准集群文件提供了来自代表性样品集的统计数据。这使得基因型能够通过参考针对给定基因座的已知数据的测定单一强度来调用。由于调用准确度与集群数据的质量相关，因此具有高效且稳健的聚类算法对于准确的基因分型至关重要。因美纳公司gebtrain2算法准确且高效地鉴定了基因分型样品的集群模式，并且报告了总结。
[0167]
实例7
[0168]
包括番茄渣的日常饮食向被鉴定为具有升高的4-eps水平的狗提供了显著益处。在一些实施例中，方法可以包括向疑似具有升高的4-eps的狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食。在一些实施例中，方法可以包括向被鉴定为具有升高的4-eps的狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食。在一些实施例中，方法可以包括测量犬科动物的4-eps，以将犬科动物鉴定为具有升高的4-eps，以及向狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食。
[0169]
在一些实施例中，方法可以包括测量犬科动物的4-eps，以及将测得的4-eps水平与阳性参考标准值进行比较，以将犬科动物鉴定为具有升高的4-eps，以及向狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食。阳性参考标准值对应于被视为相当大小、体重、年龄、品种等的狗的升高水平的4-eps。如果测得的值等于或大于阳性参考标准值，则将所述狗鉴定为具有升高的4-eps，并且通过向所述狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食治疗所述狗。
[0170]
在一些实施例中，方法可以包括测量犬科动物的4-eps，以及将所述犬科动物受试者的测得的4-eps水平与阳性对照样品的测得的4-eps水平进行比较，以将所述犬科动物鉴定为具有升高的4-eps，并且向狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食。阳性对照样品是具
有被视为对于相当大小、体重、年龄、品种等的狗来说升高水平的4-eps浓度的代表性样品。如果犬科动物受试者的测得的4-eps水平等于或大于阳性对照样品的测得的4-eps水平，则将所述狗鉴定为具有升高的4-eps，并且通过向狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食治疗所述狗。
[0171]
在一些实施例中，狗最初可以被鉴定为具有或疑似具有焦虑、焦虑症或表现出焦虑或焦虑症的症状。然后可以通过本文所述的方法之一对狗进行测试，以确定所述狗是否具有升高的4-eps水平。如果结果表明狗具有升高的4-eps，则通过向狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食治疗狗。
[0172]
在一些实施例中，狗最初可以被鉴定为具有或疑似具有应激、应激症或表现出应激或应激症的症状。然后可以通过本文所述的方法之一对狗进行测试，以确定所述狗是否具有升高的4-eps水平。如果结果表明狗具有升高的4-eps，则通过向狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食治疗狗。
[0173]
实例8
[0174]
以下组合物按每天提供的总营养计。
[0175]
在一些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，番茄渣的量相当于0.087-0.5％。在一些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，番茄渣的量相当于0.044％到约0.42％。在一些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，番茄渣的量相当于0.066％到约0.315％。在一些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，番茄渣的量相当于0.087％-0.21％。在一些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，番茄渣的量相当于约0.14％。
[0176]
在某些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，组合物可以包括量为5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％或25％的鸡肉。在某些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，组合物可以包括量为4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的鸡蛋蛋白。在某些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，组合物可以包括量为6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的玉米麸质粉。在某些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，组合物可以包括量为0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％或1.9％或2.0％的蔬菜来源。在某些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，组合物可以包括除了番茄渣之外量为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％的额外水果来源。在某些实施例中，按基于干物质的组合物的总重量计，组合物可以包括选自小米、酿酒大米、燕麦碎粒以及其组合的量为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的碳水化合物。在这些实施例的特定方面，本发明的组合物可以包括在由这些值中的作为端值的任何两个值限定的范围内的碳水化合物来源的干重。
[0177]
实例9
[0178]
表2描述了具有组合物的比例(组分组合物的干重的％)的某些实施例。
[0179]
表2
[0180][0181][0182]
包括有效量的番茄渣的日常饮食可以向被鉴定为患有应激的狗提供益处。在一些实施例中，方法包括将狗鉴定为患有或疑似患有应激、应激症或表现出应激或应激症的症状，以及向所述狗饲喂包括有效量的番茄渣的日常饮食。
[0183]
提供了包括向狗饲喂包括一定量的番茄渣的日常饮食的方法，所述量相当于每天营养摄入的0.044％到0.42％。在一些实施例中，所提供的方法包括向狗饲喂包括一定量的番茄渣的日常饮食，所述量相当于每天营养摄入的0.066％到0.315％。在一些实施例中，所提供的方法包括向狗饲喂包括一定量的番茄渣的日常饮食，所述量相当于每天营养摄入的0.087％到0.21％。在一些实施例中，所提供的方法包括向狗饲喂包括一定量的番茄渣的日常饮食，所述量相当于每天营养摄入的约0.14％。
[0184]
实例10
[0185]
表3描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0186]
表3
[0187]
[0188][0189]
实例11
[0190]
表4描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0191]
表4
[0192]
[0193][0194]
实例12
[0195]
表5描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0196]
表5
[0197]
[0198][0199]
实例13
[0200]
表6描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0201]
表6
[0202][0203]
实例14
[0204]
表7描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0205]
表7
[0206][0207]
实例15
[0208]
表8描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0209]
表8
[0210]
[0211][0212]
实例16
[0213]
表9描述了用于具有组合物的比例(组分组合物的干物质重量的％)的某些实施例的成分。
[0214]
表9
[0215]

技术特征：
1.一种将犬科动物受试者鉴定为发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的可能性增加的方法，所述方法包括：分析从所述犬科动物受试者获得的生物样品存在犬科动物受试者体内的单核苷酸多态性bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝；其中所述bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在表明所述犬科动物受试者在其生命周期内发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的可能性增加。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过进行dna测序、限制性酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应分析所述样品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品为基因组dna样品。4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述样品从所述犬科动物受试者的血液、唾液、毛囊根、鼻拭子或口腔拭子获得，优选地从唾液获得。5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中通过进行至少一种选自以下的核酸分析技术分析所述样品：dna测序、限制性酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应。6.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中通过进行至少一种选自以下的核酸分析技术分析所述样品：使用全基因组snp芯片进行的分析、单链构象多态性(sscp)测定、限制性片段长度多态性(rflp)、自动荧光测序、钳位变性凝胶电泳(cdge)、变性梯度凝胶电泳(dgge)、迁移率变动分析、限制性酶分析、异源双链分析、化学错配切割(cmc)、rna酶保护测定、识别核苷酸错配的多肽的使用、等位基因特异性pcr、序列分析和snp基因分型。7.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中通过进行至少一种选自以下的核酸分析技术分析所述样品：基于杂交的方法、基于酶的方法、基于dna的物理性质的扩增后方法以及测序方法。8.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中通过进行至少一种选自以下的核酸分析技术分析所述样品：基于杂交的方法，所述基于杂交的方法选自由以下组成的组：动态等位基因特异性杂交、分子信标方法和snp微阵列；基于酶的方法，所述基于酶的方法选自由以下组成的组：限制性片段长度多态性(rflp)、基于pcr的方法、瓣状核酸内切酶、引物延伸方法、5'-核酸酶和寡核苷酸连接测定；基于dna的物理性质的扩增后方法，所述基于dna的物理性质的扩增后方法选自由以下组成的组：单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、高分辨率扩增子熔解、dna错配结合性蛋白、snplex和surveyor核酸酶测定；以及测序方法。9.一种预防或降低犬科动物受试者的升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的方法，所述方法包括：根据权利要求1到8中任一项检测来自所述犬科动物受试者的生物样品中bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在；以及向所述犬科动物受试者施用包括有效量的番茄渣的组合物。10.一种预防或降低犬科动物受试者的升高的4-乙基苯基硫酸盐水平的方法，所述方法包括：根据权利要求1到8中任一项检测来自所述犬科动物受试者的生物样品中bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在；以及
向所述犬科动物受试者饲喂包括有效量的番茄渣的营养组合物。11.一种治疗犬科动物受试者的犬科动物焦虑或犬科动物应激的方法，所述方法包括：根据权利要求1到8中任一项检测来自所述犬科动物受试者的生物样品中bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在；以及每日向所述犬科动物受试者施用包括有效量的番茄渣的组合物。12.根据权利要求11所述的方法，其中在分析所述生物样品之前，所述犬科动物受试者表现出犬科动物焦虑或犬科动物应激的症状。13.一种治疗犬科动物受试者的犬科动物焦虑或犬科动物应激的方法，所述方法包括：根据权利要求1到8中任一项检测来自所述犬科动物受试者的生物样品中bicf2p1175095的次要等位基因的两个拷贝的存在；以及每日向所述犬科动物受试者饲喂包括有效量的番茄渣的营养组合物。14.根据权利要求13所述的方法，其中在分析所述生物样品之前，所述犬科动物受试者表现出犬科动物焦虑或犬科动物应激的症状。15.一种用于治疗动物的焦虑或应激的方法，所述方法包括向所述动物施用有效量的番茄渣。16.根据权利要求9到15中任一项所述的方法，其中向所述动物施用相当于每天营养摄入的0.044％到0.42％的番茄渣。17.根据权利要求16所述的方法，其中向所述动物施用包括相当于每天营养摄入的0.044％到0.42％的番茄渣的食品组合物。18.根据权利要求9到15中任一项所述的方法，其中向所述动物施用相当于每天营养摄入的0.066％到0.315％的番茄渣。19.根据权利要求18所述的方法，其中向所述动物施用包括相当于每天营养摄入的0.066％到0.315％的番茄渣的食品组合物。18.根据权利要求9到15中任一项所述的方法，其中向所述动物施用相当于每天营养摄入的0.087％到0.21％的番茄渣。19.根据权利要求18所述的方法，其中向所述动物施用包括相当于每天营养摄入的0.087％到0.21％的番茄渣的食品组合物。20.根据权利要求9到15中任一项所述的方法，其中向所述动物施用相当于每天营养摄入的0.14％的番茄渣。21.根据权利要求18所述的方法，其中向所述动物施用包括相当于每天营养摄入的0.14％的番茄渣的食品组合物。22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法，其中所述犬科动物被鉴定为具有升高的4-乙基苯基硫酸盐水平。23.根据权利要求1到21中任一项所述的方法，其中所述犬科动物先前已被鉴定为患有犬科动物焦虑。24.根据权利要求1到21中任一项所述的方法，其中所述犬科动物先前已被鉴定为具有犬科动物应激症状。25.一种犬科动物食品组合物，其包括一定量的番茄渣，所述量相当于每天营养摄入的0.087％到0.21％。
26.一种犬科动物食品组合物，其包括一定量的番茄渣，所述量相当于每天营养摄入的0.14％。

技术总结
公开了将犬科动物受试者鉴定为发生升高的4-乙基苯基硫酸盐水平、犬科动物应激、犬科动物焦虑和/或对有益微生物生长的抑制和对有害微生物生长的促进的可能性增加的方法。方法包括分析从所述犬科动物受试者获得的生物样品存在犬科动物受试者体内的单核苷酸多态性BICF2P1175095的次要等位基因的两个拷贝。还公开了通过施用有效量的番茄渣治疗鉴定出的犬科动物受试者的方法。公开了治疗犬科动物受试者的升高的4-EPS水平、犬科动物焦虑或犬科动物应激的方法。公开了包括番茄渣的犬科动物食品组合物。食品组合物。食品组合物。

技术研发人员：伊登
受保护的技术使用者：希尔氏宠物营养品公司
技术研发日：2019.12.19
技术公布日：2022/7/28